李岩薄层色谱鉴别介绍

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1、薄层色谱法 概念薄层色谱法(TLC)将固定相(如硅胶)薄薄地均匀涂敷在底板 (或棒)上，试样点在薄层一端，在展开罐内 展开，由于各组分在薄层上的移动距离不同 ，形成互相分离的斑点，测定各斑点的位置 及其密度就可以完成对试样的定性、定量分 析的色谱法。 薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它 利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在 移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程 中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解 吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。 基本原理v在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层 厚度等），化合物移动的距离和展开剂移 动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物 的物理常数，其大

2、小只与化合物本身的结 构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。比移值组分二组分一被分离 混合物薄层色谱展开示意图薄层色谱法优点 操作简单，定性结果直观缺点有一定毒性、定量方面的精密度 较差v实验仪器 载板 固定相（吸附剂）或载体 涂布器 点样器 展开室 实验操作实验操作 1 薄层板的制备吸附剂（硅胶）调制玻璃板涂布 调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。 均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。 使用前放入烘箱内，在105-115左右烘干40-50min。冷 却后使用。粘合剂、添加剂固定相（吸附剂）的选择纤维素、淀粉硅酸镁硫酸钙硅胶 佛罗里硅土 氧化镁氧化铝活性炭对极性有机物的吸附作用增强v2 供试品的制备

3、：按照各药品质量标准 规定的方法进行提取分离。制得的供试品 应放置于密塞的小瓶中，防止溶剂挥发影 响点样量。 3 对照品溶液的制备：可按质量标准规 定精配成一定浓度的对照品溶液，置密塞 小瓶中备用。标准药材对照溶液，一般需 照供试品的制备方法制备。在使用对照品 溶液时一定要注意将取样的毛细管充分洗 干净，防止造成对照品污染。4 点样：按规定吸取溶液用定量点样毛细 管或色谱用微量注射器点样于薄层板上。 点样基线距底边的距离为12cm，点间距 一般为1.0-1.5cm。点样直径一般应小于 5mm。两个以上的点样应在同一水平线上 ，并与薄层板的底边平行。点样时必须注 意勿损伤薄层表面。点样示意图对照

4、品 样供试品样点样直径5mm1cm点间距1.5cm1-2cm自动点样器毛细管点样v5 展开v展开室v展开剂（流动相）的选择：主要根据样品中 各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解 度等因素来考虑。展开剂的选择正己烷 环己烷 四氯化碳 甲苯 氯仿 正丁醇 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 甲醇 水溶剂的洗脱能力随溶剂的极性增大而增强在一块薄层板上进行试验： 若所选展开剂使混合物中所有的组分点都移到了溶剂前沿，此溶剂的极 性过强； 若所选展开剂几乎不能使混合物中的组分点移动，留在了原点上，此溶剂 的极性过弱。 理想的展开剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大。各组分理想的比移值在0.2-0.8之间。当

5、一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的展开剂组合。 1-2cm展开示意图展开剂要接触到薄层板下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子，展开。观察展开情况。取出薄层板上升法倾斜上行法下降法展开方式示意图v影响展开的因素 A 相对湿度的影响 B 溶剂系统的影响C 溶剂蒸汽的影响 D 薄层板类型的影响 E 温度的影响 F 展距的影响A 相对湿度的影响吸附剂的活度随相对湿度的增大而降低。20cm20cm的硅胶薄层板在50%的相对湿度中：放置3分钟 失去活性一半放置15

6、分钟 吸附水分达最大值 薄层在相对湿度为1-80%的情况下展开，Rf值可 以相差3倍。 最佳相对湿度范围决定于溶质和溶剂的极性，极 性越大，相对湿度范围也相应增大。B 溶剂系统的影响溶剂系统不同，组分的分配系数不同， 故Rf值不同。在平面电泳中，溶液的离子强度增大 ，组分的泳动速度减小。预饱和分为2部分： 1、展开缸的预饱和：在展开之前，使展开剂 蒸汽在展开缸内饱和，使展开缸汽液状态达 到一定的稳定状态，此时尚未放薄层板。 2、薄层板的预饱和：在展开缸饱和后，放入 已经点样完毕的薄层板，进行饱和，使薄层 板整体差异性减小。具体做法是：在双槽层 析玻璃缸内,将其中一个槽内倒入配好的展开 剂,另一

7、个槽内放入薄层板,盖好上面的玻璃 盖,这时候就是在预饱和。C 溶剂蒸汽的影响v关于饱和时间：根据展开剂而定。v 1、展开剂组分极性差异不大的且挥发性好的，时间可以短一些，一 般1520分钟即可； 2、极性差异大的，且挥发性差异大的，时间要长一些，一般要30 60分钟； 3、极性差异大的，且挥发性差异不大的，时间要长一些，一般要20 30分钟； 4、极性差异不大，且挥发性差不大的，时间可以短一些，一般要10 15分钟； 5、水饱和有机试剂或有机试剂饱和水的，时间一般都比较长，30 60分钟。 6、另外，大家打开关闭展开缸的速度要快，放板取板的速度也要快 ，v否则预饱和的效果全被你后期的 v操作给

8、抹杀了！ D1滤纸 纸色谱中所用的滤纸性质对分离效果有很大影响。对滤纸的要求是：1.物理性质均匀、 质地均一、厚薄一致，否则斑 点畸形，Rf值改变; 2. 具有一定的机械强度; 3. 纤维松紧程度适当; 4. 具有一定的纯度; 5. 纸面洁净，不含有溶于水及有机溶剂的物质。D 薄层板类型的影响色谱用滤纸纤维的方向会影响组分的分 离，故每次展开时,滤纸的纤维方向应一致.商品滤纸有厚纸、薄纸、慢速、快速、中速等不同类型可供选择.D2薄层板有资料表明，60%以上的薄层分离用硅胶作为吸附剂，其次为纤维素、氧 化铝、聚酰胺、硅藻土等。固定相硅胶 硅胶是一种弱酸性的多孔性无定形吸附剂。硅胶表面有很多硅醇基

9、(SiOH)，通过硅 原子上的-OH基团与极性化合物或不饱和化合 物形成氢键而表现出吸附性能。硅醇基的数目 越大，则吸附能力增强。 硅胶也能吸附水分而成为水合硅醇基。氧化铝氧化铝由氢氧化铝高温脱水而成。按制备方法不 同，氧化铝可分为三种： 碱性氧化铝：pH = 910,可分离合成染料，生物碱等 酸性氧化铝：pH = 45，适应于酸性物质的分离 中性氧化铝：pH = 77.5，适于分离醛酮，以及对酸碱 不稳定的脂和内酯等化合物 氧化铝的活度与其含水量有关，含水量大，则吸 附能力小。活性级别含水量%-361015纤维素纤维素分子中带有许多羟基，亲水性强，分离原理与纸色谱相似，但分离效果和分离速度均

10、比纸色谱佳，可以代替纸色谱.普通纤维素：天然纤维素、高纯度纤维素 、微晶纤维素。乙酰化纤维素：用乙酸将纤维素结构上的 羟基酯化而成，适用于反相色谱。离子交换纤维素：纤维素经化学反应，使 分子中一部分羟基上的氢被阳离子或 阴离子交换基取代而成，具有离子交换树 脂的性质。纤维素的种类有：聚酰胺聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物。 薄层色谱中常用的聚己内酰胺，结构如下：酰胺中心的酰胺基可与酚类、酸类、硝基类等化合物形成氢键而对这些物质产生吸附作用。应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离。-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-C-N-nHO葡聚糖葡聚糖是一种由葡萄糖残基构成的多糖物质。葡聚糖凝胶

11、是由一定分子量的葡聚糖悬浮于有机相中，加入交联剂交联聚合而成。在葡聚糖分子上引入有机基团，则可成为亲脂性凝胶。在葡聚糖凝胶上引入羧甲基、磺乙基等，则制成具有离子交换性质的葡聚糖凝胶离子交换剂。应用：蛋白质、肽、多糖、核苷酸等的分离薄层板的种类v载板材料：玻璃片、铝箔、塑料片等v薄层板类型：1.硬板：在固定相中加入粘合剂（煅石膏、淀粉）;2.软板：不加粘合剂;3.烧结玻璃板：将玻璃粉与硅胶、氧化铝等吸附剂按一定比例混合后，以丙酮、乙醇或水等溶剂调成匀浆，涂成薄层，经高温烧结而成。吸附剂及预制板包装上的符号及含义vG加入一定的煅石膏作粘合剂vH不加粘合剂，供制各种软板用vF254加入对254nm波

12、长能发荧光的物质vF254s加入抗酸性荧光指示剂E 温度的影响温度影响物质的分配系数KD，同时也影响纤维的水合作用，改变固定相的量。F 展距的影响v薄层色谱法-跑板v点样 v用微量进样器进行点样。点样前，先用铅笔在层 析上距末端2cm 处轻轻画一横线，然后用毛细管 吸取样液在横线上轻轻点样，点的斑点较小，展 开的色谱图分离度好，颜色分明。如果要重新点 样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点 样（用电吹风的热风吹干再点），以免点样斑点 过大。一般斑点直径大于2mm，不宜超过5mm。 点好样的薄层板用电吹风的热风吹干。底线距基 线125cm，点间距离为lcm左右，样点与玻 璃边缘距离至少lcm

13、，为防止边缘效应，v2.展开 v将点了样的薄层板放在盛在有展开剂的展开槽中，由于毛细管作用， 展开溶剂在薄层板上缓慢前进，前进至一定距离后，取出薄层板，样 品组分固移动速度不同而彼此分离。v展开室应预饱和。为达到饱和效果，可在室中加入足够量的展开剂， 密封室顶的盖。v展开剂一般为两种以上互溶的有机溶剂，并且临用时新配为宜。强烈 振摇使混合液充分混匀，放置，如果分层，取用体积大的一层作为展 开剂。绝对不应该把各组成溶液倒入展开缸，振摇展开缸来配制展开 剂。混合不均匀和没有分液的展开剂，会造成层析的完全失败。各组 成溶剂的比例准确度对不同的分析任务有不同的要求，尽量达到实验 室仪器的最高精确度，比

14、如：取1ml的溶剂，应使用1ml的单标移液管 ，v薄层板点样后，应待溶剂挥发完，再放人展开室中展开。v展开应密闭，展距一般为815cm。薄层板放入展开室时，展开剂不 能没过样点。一般情况下，展开剂浸入薄层下端的高度不宜超过 0.5cm。v展开剂每次展开后，都需要更换，不能重复使用。（展开缸中得展开 剂弃去，密封在容量瓶中得展开剂可在当天使用）v展开后的薄层板用适当的方法，使溶剂挥发完全，然后进行检视。vRf值一般控制在0.30.8，当Rf值很大或很小时，应适当改变流动相 的比例。v3.斑点的检出v展开后的薄层板经过干燥后，常用紫外光灯 照射或用显色剂显色检出斑点。对于无色组 分，在用显色剂时，

15、显色剂喷洒要均匀，量 要适度。紫外光灯的功率越大，暗室越暗， 检出效果就越好。v展开分离后，化合物在薄层板上的位置用比 移值(Rf值)来表示。化合物斑点中心至原点 的距离与溶剂前沿至原点的距离的比值就是 该化合物的Rf值。v注意事项： v一预饱和分为2部分：v1、展开缸的预饱和：在展开之前，使展开剂蒸汽在展开缸内饱和，使展开缸 汽液状态达到一定的稳定状态，此时尚未放薄层板。 v2、薄层板的预饱和：在展开缸饱和后，放入已经点样完毕的薄层板，进行饱 和，使薄层板整体差异性减小。具体做法是：在双槽层析玻璃缸内,将其中一 个槽内倒入配好的展开剂,另一个槽内放入薄层板,盖好上面的玻璃盖,这时候就 是在预

16、饱和。v关于饱和时间：根据展开剂而定。 1、展开剂组分极性差异不大的且挥发性好的，时间可以短一些，一般1520 分钟即可； 2、极性差异大的，且挥发性差异大的，时间要长一些，一般要3060分钟； 3、极性差异大的，且挥发性差异不大的，时间要长一些，一般要2030分钟 ； 4、极性差异不大，且挥发性差不大的，时间可以短一些，一般要1015分钟 ； 5、水饱和有机试剂或有机试剂饱和水的，时间一般都比较长，3060分钟。 6、另外，大家打开关闭展开缸的速度要快，放板取板的速度也要快，否则预 饱和的效果全被你后期的 v操作给抹杀了！v二展开室应放在水平、稳定的实验台上，不能有阳光直 射，也不能在通风处放置，离开热源，避免温度波动对分 离不利；光敏物质的分离应将展开室置于暗处进行。v三点样时间不应超过三分钟。硅胶的硅醇基以氢键