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1、食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验国标修订协作组 中国CDC营养与食品安全所李斯特氏菌属李斯特氏菌属（Listeria ）普遍存在于环境中 ，最新的分类学研究表明，其分为六个种：单核增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）伊氏李斯特氏菌（Listeria ivanovii）英诺克李斯特氏菌（Listeria innocua）斯氏李斯特氏菌（Listeria seeligeri）威氏李斯特氏菌（Listeria welshimeri）格氏李斯特氏菌（Listeria grayi）在李斯特氏菌属的六个种中，只有两种致病菌： 单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其 他
2、动物发病。但是，其中通常只有单核增生李斯特氏菌和 人类的李斯特氏菌症（listeriosis）相关。因此，李斯 特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。 单增李斯特氏菌能引起人、畜的李斯特氏菌病，感染后主要 表现为败血症、脑膜炎和流产等。它广泛存在于自然界中。 肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都可被污染。 该菌在4的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健 康的主要病原菌之一。 其易感人群主要为孕妇、老人、新生儿和免疫缺陷人群。大 多数发达国家人类李斯特菌病发生率约为每一百万人2-15例 ，死亡率为13-34% 加拿大由单增李斯特氏菌污染肉制品引发李斯特菌病暴发， 导致十几人死亡。
3、很多国家都已经采取措施来控制食品中的 单增李斯特氏菌，并制定了相应的标准。方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法SN 0184 - 1993加 工MBP 30，18- 24hEB 30，24/48hMMA/ OXA （35，24-48h）蓝色菌落；典型运动；过氧化氢酶； 革兰氏染色；溶血试验；尿素酶试验 ；硝酸盐还原；MR-VP；三糖铁；糖 发酵；动力试验；协同溶血*；血清 学检验*；小鼠毒力试验*无未 加 工EB （30，24/48h）GB/T 4789.30- 2003EB （301，48h）MMA （301，24-48h ）蓝色菌落；三糖铁；动力试验；染色 镜检（革兰氏染色、典型运动）
4、；生 化特性（溶血反应、硝酸盐还原、尿 素酶、MR-VP、糖发酵）；小鼠毒力 试验；协同溶血无LB1 （301， 24h）LB2 （301， 24h）FDABLEB+Phy （30，4h ）BLEB+Phy+ 三种抑菌剂 （30， 20/44h）OXA/PALCAM/MO X/LPM+七叶灵 +Fe3+ 推荐BCM /ALOA / RapidLmono /CHROMagar Listeria蓝色菌落*；典型运动或动力试验； 过氧化氢酶；革兰氏染色；溶血试验 ；硝酸盐还原*；糖发酵；协同溶血 ；血清学检验；小鼠毒力试验*筛选、鉴定都可以使 用快速方法USDAUVM （302， 222h）FB （
5、352， 26-482h）MOX （352，26- 482h）初步鉴定：纯菌菌落形态；典型运动 ； 生化鉴定：MICRO-ID Listeria或 Api Listeria或BAM等方法中的传统 生化反应；协同溶血 遗传鉴定：核糖体RNA检测；PFGE*筛选用的快速方法必 须经过确认后才可使 用 鉴定中用到MICRO- ID 、Api、 GenProbe AccuProbe 、GENE-TRAK方法名称一次增菌二次增菌分离鉴定快速方法CFIA MFHPB- 30LEB（ UVM） （30， 24/48h）MFB （35，24- 48h）OXA+LPM或 MOX或 PALCAM典型运动或动力试验
6、；溶血 试验；甘露醇；木糖；鼠李 糖；快速鉴定试剂盒*；过氧 化氢酶*；革兰氏染色*；协 同溶血*；血清学试验*作为鉴定的可选 步骤，允许使用 快速方法，如 Vitek或API、 Micro ID Listeria 、Listera AccuprobeISO 11290 -1:1996（ E）半量Fraser 肉汤 （30， 242h）Fraser肉汤 （35或37， 482h）OXA和 PALCAM （30、35或37 ，24-48h，） PALCAM平板 微需氧或好氧条 件培养蓝色菌落*；过氧化氢酶；革 兰氏染色；动力试验或典型 运动*；溶血试验；糖发酵试 验；协同溶血；送参考实验 室（血
7、清或噬菌体分型）无NMKL No.136 2nd 1999LB （ 30.01.0 ，243h）LB（ 30.01.0， 243h）或 Fraser肉汤（ 37.01.0， 484h）OXA和 PALCAM （37.01.0， 243/484h，好 氧或微需氧）溶血试验；过氧化氢酶；革 兰氏染色；典型运动 动力试验；糖发酵试验；送 参考实验室（血清、噬菌体 、DNA或酶分型）允许使用经过确 认的商业化生产 的单核增生李斯 特氏菌菌株鉴定 试验，但没列明 具体试剂盒名称检测程序 目前常用的单核增生李斯特氏菌 检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、 Fraser肉汤（FB）、UVM（Modifi
8、ed University of Vermont broth，也叫 UVM1）、LEB（Listeria enrichment broth）和BLEB（buffered Listeria enrichment broth） 半量Fraser肉汤和Fraser肉汤n具有选择性和区别性。n加入柠檬酸铁铵和七叶灵，起到区别的作用。李斯特 氏菌可以水解七叶灵，与培养基中的铁离子反应，使 培养基变黑，可直观的从培养液的颜色就可以判断是 否有单核李斯特氏菌的生长。n氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。n半量Fraser肉汤与Fraser肉汤所用的添加剂一样半量Fraser肉汤：萘啶酮酸10mg/L，吖
9、啶黄12.5mg/LFraser肉汤：萘啶酮酸20mg/L，吖啶黄的25mg/L UVMnUVM只有选择性没有区别性n加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄，作为选择 性因子。虽然其中含有七叶灵，但是没 有添加柠檬酸铁铵，不能发生黑色的颜 色反应。LEB和BLEBn只有选择性没有区别性nLEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、 萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子；加入 的丙酮酸钠，有助于受损细胞的恢复；不 含七叶灵和柠檬酸铁铵，无颜色反应nBLEB是在LEB基础上加入缓冲体系：磷酸二 氢钾和磷酸氢二钠检测程序 -分离n分离培养基有：OXA、PALCAM、LPM、MOX等，但首 选仍然是OXA。分离原理主要
10、是基于李斯特氏菌具 有D葡萄糖苷酶的活性，能水解培养基中的 七叶灵，产生七叶苷，与铁离子产生颜色反应而 ，使菌落为棕褐色，并带有褐色晕圈。n还有一些选择性显色培养基，如BCM、ALOA、 CHROMagar listeria、RapidL. mono等。修订原则n参照FDA、AOAC、ISO、 AFNOR等有关标 准，使本标准更接近现行国际标准 n保持与原标准的连续性 修订依据nFDA BAM (2001) chapter10nAOAC 975.55 987.09 nISO11290-1 nAFNOR DGAL/SDHA/N93nUSDA/FSIS Microbiology laborator
11、y Guidebook 3rd Edition nCanada Health and Welfare Canada MFHPB- 30n各省、市CDC和其他系统专家提出的修改意见修订内容n单增李斯特氏菌选择性增菌肉汤的比较 和筛选n单增李斯特氏菌选择性培养基的比较和 筛选n初筛步骤选择性增菌肉汤的比较和筛选方法培养基FDA BLEB USDA Fraser 国内ISO ISO Fraser 国内SN SN Fraser 原国标EB 和LB n 根据各省反馈 意见及长期使 用经验，EB增 菌液增菌效果 远远低于LB增 菌液选择性增菌肉汤的比较和筛选n通过对高污染及低污染食品进行增菌效 果比对，结
12、果表明： LB肉汤的增菌效果 最佳nBLEB更适于背景微生物较少的熟食样品n修订标准选择LB增菌肉汤分离培养基的比较和筛选方法培养基 原国标MMA AFNOR OXA、PALCAM FDA MMA、OXA、LPM USDA MOX Health Welfare CanadaPALCAM、OXA比对试验：1.MMA 2.进口OXA3.进口PALCAM 4.国产OXA 5.国产PALCAM6.CHROMagarn高污染食品及低污染食品的分离效果比较农贸市场生肉、熟肉样品超市生肉样品 n回收率比较MMAPALCAMOXACHROMagar3048h菌落 针尖大小、 形态不典型 ，与杂菌难 区分抑制性
13、 强3724h48h ，2mm灰绿色 中心黑色凹陷 ，菌落周围呈 棕黑色水解圈3024h 48h,2mm灰黑 色菌落周围呈 棕黑色水解圈3718h-24h, 蓝色菌落周围 呈白色晕圈L.M在OXA培养基生长特征L.M在PALCAM培养基生长特征L.M在 Chromagar培养基生长特征MMA抑制性强，菌落小、形态不典型，很难 与杂菌区分 进口PALCAM 、进口OXA菌落较典型，易与 杂菌区分 CHROMagar菌落较典型，易与杂菌区分，对 高污染食品中的杂菌抑制性较差n回收率：进口PALCAM和CHROMagar较高，结果稳定n进口PALCAM和科玛嘉均优于进口OXA、国 产PALCAM、国
14、产OXA和MMA。背景微生物 较少时，科玛嘉的分离效果最好；背景 微生物较复杂时，进口PALCAM分离效果 最好n根据各省长期使用经验及本次实验结果 结合参考文献，修订标准拟采用PALCAM 和CHROMagar分离培养基检样 25 g(ml)样品+LB1增菌液225 mL，均质0.1 mL+10 mL LB2增菌液科玛嘉李斯特菌显色培养基 PALCAM琼脂接种木糖、鼠李糖，36 1 ，24 h；同时于TSA-YE平板划线纯化，30 1 ，24 h48 h木糖-，鼠李糖+鉴定结果报告30 1 ，24 h30 1 ，18 h24 h36 1 ，24 h48 h单增李斯特氏菌生化性状与其种间的区别
15、菌种 溶血反应协同溶血葡萄糖麦芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏 菌(L.monocytogenes)/格氏李斯特氏菌 (L.grayi)/斯氏李斯特氏菌 (L.seeligeri)/威氏李斯特氏菌 (L.welshimeri)/V伊氏李斯特氏菌 (L.ivanovii)/英诺克李斯特氏菌 (L.innocua)/V注：阳性；阴性；V反应不定。n 加标菌悬液浓度的确定菌落平板计数MPN法计数n 人工污染样品，通过修订的方法检测样 品中的单增李斯特氏菌，从而确定该方 法的检测限为1-10cfu/25g/ml1.初筛在我们前期工作中发现，高污染样品 在选择性琼脂平板上可疑菌落
16、较多，为 避免漏检和减少工作量，增加初筛步骤 ：挑取典型或可疑菌落接种在木糖、鼠 李糖发酵管中，无须烧环同时TSA-YE平 板上划线分离纯菌。由于在李斯特氏菌属中，只有单增李斯 特氏菌与无害李斯特菌的木糖与鼠李糖 发酵结果相同，即木糖阴性为蓝色，鼠 李糖阳性为黄色。在TSA-YE平板上可疑 菌落为淡蓝色或蓝灰色。对木糖、鼠李 糖典型反应的菌落，可直接从TSA-YE平 板上挑取进行进一步的实验2.商业生化鉴定系统的应用原国标中未涉及，FDA、AOAC标准使用API 10300、Vitek GNI（AOAC 989.13），这 些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国 家和组织的标准采用。 我国许多单位也积累了较多的经验，使用最广 泛的是A
