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1、1细菌耐受噬菌体突变率的测定细菌耐受噬菌体突变率的测定微生物创新性试验微生物创新性试验第五组第五组：2细菌耐受噬菌体的突变是一种自发突变，它的发生与环境因子无关，是随机的非定向突变。本组设计性实验题目：测定铜绿假单胞菌耐受噬菌体的突变频率3实验选材依据和背景 铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土 壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、 空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都 有本菌存在。本菌存在的重要条件是潮湿 的环境。4革兰染色 培养绿脓杆菌研究背景 本菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原 菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的 患者，及术后或某些治疗
2、后的患者易感本菌。 筛选出优良菌种，以便更好地利用其资源进行 研究并造福人类。同时又对其外界环境有更大 的适应性，更好应用于发展、生产的需要。为 获得其菌群，我们采用利用噬菌体将其敏感细 菌杀死，从而选择耐受细菌。 56研究研究概述概述研究方案：为获得其菌群，我们采用噬菌体将敏 感细菌杀死，将发生了耐受突变的细菌选择出来 ，并繁殖成为优势菌群。研究意义：培养出优势菌群，为以后临床治疗 及临床用药起辅助性作用。研究目的：测定细菌自然情况下耐受噬菌体的 自发突变频率。研究问题：突变率测定实验材料 1.毒性噬菌体及其相应的敏感宿主菌。（建议使用人体正常菌群中的细菌及其噬菌体 ，如大肠埃希菌或铜绿假单
3、胞菌及其相应噬菌 体。） 2.LB液体培养基及LB固体培养基。 3.试管、培养皿、刻度定量吸管。 4.酒精灯、接种环、显微镜、普通培养箱等。7LB是什么？ LB：Luria-Bertani培养基，即溶菌肉汤。8实验步骤9 1.准备好铜绿假单胞菌的过夜培养物和相应 的噬菌体原液（噬菌体效价1010）铜绿假单胞菌的 倒置过夜培养物噬 菌 体 原 液实验步骤 2.将菌液10倍连续稀释，至少稀释7管，取 0.1ml涂布接种LB琼脂平板，37度培养过夜 。次日取菌落适宜于菌落计数的平板进行 CFU计数，计算出每毫升菌液中的CHU数 ：CFU数=每个平皿中的CFU数10血清稀释倍数10 2.1110倍连续
4、稀释，至少7管CFU是什么？ CFU (Colony-Forming Units)：菌落形成单 位,菌落形成单位。 将稀释后的一定量的菌液通过浇注或涂布的方法，让其内 的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上，待培养后，每一 活细胞就形成一个菌落。与常规利用显微镜对微生物数量 进行测量不同，主要是对可见（即多数情况下形成菌落） 的细菌数量进行测量的单位。 单位：CFU/mL。指的是每毫升样品中含有 的细菌群落总数，也有用CFU/g即对应固体 培养基。12通俗的解释是指每毫升菌液中含有多少单细胞 。传统上 就叫“个”。但是，我们知道，一个菌落不一定是 一个细菌所生成，也可能是由一簇细菌（一个细 菌团）
5、所生成，这时候再叫“个”就不太准确啦， 准确的叫法就是“菌落形成单位”，英文缩写“CFU” 。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，数量上没 有变化。 13实验步骤3.进入对数生长后期的大肠埃希菌或铜绿假 单胞菌，菌数约为109CFU/ml左右。23h后，可见菌液逐步变清，待完全变清 （月4h之内），将全部菌液均匀涂布到一 个LB琼脂平板上，置37下培养过夜。次 日计数CFU。144.耐受噬菌体突变频率的计算第3步中获得的CFU数为1ml菌液中的耐受 菌数量，第2步中获得的CFU数为1ml菌液 中的总菌数。故：耐受噬菌体突变频率 =15第3步中获得的CFU数 第2步中获得的CFU数实验可行性分
6、析1. 标本采集方便 本菌在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见 的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼 吸道和肠道等都有本菌存在。本菌存在的重要条 件是潮湿的环境。 采自不同感染部位的标本，包括血液、尿液、痰 标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中 的各种标本如水、空气、物体表面采样等。162.分离培养容易 本菌生长对营养要求不高。 3. 生长特点明显 该菌在4不生长而在42 可以生长。（可用以鉴别） 4.采用CFU计数的科学性。 5.实验现象明显，便于观察。17预期结果18稀释度10-110-210-71 2 3平 均12 3平 均1 2 3平 均CFU数/ 平板 每毫升 的CFU
7、数 预期结果 经相关文献预测：铜绿假单胞菌耐噬菌体的突变机率在 1.410-77.910-7之间。19讨论 上述操作3，通常在4h内菌液会完全变清。此时细菌尚处于生长曲线的“迟缓期”（即适 应期），亦即尚未进入分裂状态。如果少 数事先存在的耐受菌已进入分裂期，这是 测定结果会被放大，因而失其准确性。20思考题(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45左右 才能倒平板？ (2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个 关键？为什么？ (3)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计 数法的优缺点。21参考文献 微生物学通报 MICROBIOLOGY国际标准刊号：ISSN 0253-2654国内统一刊号：CN 11-1996/Q铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定及耐噬菌体突变频率测定张克斌 陈志瑾 等 第三军医大学基础部微生物学教研室2223
