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1、实验三 食品中金黄色葡萄球菌的检测o 检测方法：1、参照GB 4789.10-2010金黄色葡萄球菌检测2、食品微生物学实验原理与技术实验三十 食品中金黄色葡萄球菌检测o 实验目的：1、了解金黄色葡萄球菌检验原理；2、掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一个种，可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素，如果在食品中大量生长繁殖并产生毒素，可引起食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在的危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。o金黄色葡萄球菌性质及培养特征1、革兰氏阳性球菌，排列为葡萄状，无芽孢、无荚膜。金黄色葡萄球菌的 扫描电镜照片经1824小时
2、培养后形成圆形隆起、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的菌落，直径为12mm，不同菌株可产生不同色素，出现金黄色、白色、柠檬色。大肠杆菌在普通营养琼脂上的菌落特征：中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐2、在普通营养琼脂平板上的菌落特征：金黄色葡萄球菌在普通营养琼脂平板上的菌落3、具有高耐盐性，在7.5%氯化钠肉汤中呈现浑浊生 长；4、在BP平板上菌落特征：圆形、光滑凸起，湿润， 直径为23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色 ，周围有一浑浊带，外层有一透明圈；5、在血平板上菌落特征：呈金黄色，有时也呈白色 ，大而凸起，圆形，不透明，表面光滑，周围有 溶血圈；BP培养基上的菌落血平板上的菌
3、落6、血浆凝固酶试验致病性菌株可以产 生血浆凝固酶，使血浆 发生凝固。o原理：鉴定食品中金黄色葡萄球菌：根据以上性质逐步确 定。 鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标：金黄色葡萄球菌能产生凝血浆酶，使血浆凝固；多数金黄色葡萄球菌致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。o实验材料：1、样品：（1）含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的水 样 （2）鲜奶2、培养基与试剂：7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基、无菌水、革兰氏染色剂3、器具及其他用品：显微镜、恒温培养箱、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、载玻片、涂布器、酒精灯、接种环等流 程1、增菌
4、培养法1.1检样处理：无菌操作取样25g（mL）加入225mL灭 菌生理盐水，固体样品研磨或均质制成混悬液。1.2增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于 7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内 ，361培养24h，转种血平板和BP平板， 361培养24h，挑取血平板上金黄色（有时 为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶 实验。1.3兔血浆凝固酶试验：吸取1：4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中 ，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤 培养物0.5mL，振荡摇匀，置361温箱或水 浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固 ，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为
5、 阳性结果，同时与已知阳性和阴性葡萄球菌菌株 及肉汤作为对照。2.1 梯度稀释转种BP平板吸取上述1：10混悬液，进行10倍第次稀释 ，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液 1mL，分别加入三块BP平板，每个平板接种量分 别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌涂布器 涂布整个平板，如水分多不易吸收，可将平板 放在3611h，等水分蒸发后反转平皿置 361培养。2、直接计数方法2.2转种血平板在三个平板上寻找周围有浑浊带的黑 色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种 血平板， 于361培养24h后进行染 色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培 养方法。2.3 菌落计数将三个平板中疑似金黄
6、色葡萄球菌黑 色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数， 除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克 样品中金黄色葡萄球菌数。结果1.根据形态特征、血平板情况以及血浆凝固酶 试验，判别检样中是否含有金黄色葡萄球菌 。2.估算检样中金黄色葡萄球菌的含量。GB 4789.10-2010第 一 法 金 黄 色 葡 萄 球 菌 定 性 检 验GB 4789.10-2010第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数GB 4789.10-2010第三法 金黄色葡萄球菌MPN计 数三法特点及适用性：o 第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验o 第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的
7、计数o 第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。实 验 安 排1、实验时间：2、分组：每3人一组3、评分标准：见附表1考核要素评评分要素评评分细则细则 菌的 鉴别鉴别 10分菌落形态态、 色泽观泽观 察对对菌的特征熟悉、识别识别 正确（10分）对对菌的特征较较熟悉，基本能识别识别 （10分）不熟悉，识别识别 不正确（5分以下） 菌的 分离 10分接种操作 5分操作规规范、熟练练、能分离出单单个菌落45分基本规规范、熟练练，基本能分离出单单个菌落24分不熟练练，分离差（02分） 分离效果 5分效果好，有单单个菌落（45分）能基本分离（24分）一般（02分） 染色 操作 20分涂片操作 10分熟练练、染色效果明显显（910分）较较熟练练，染色效果尚好（68分）染色效果较较差（5分以下） 显显微镜镜的使 用10分正确、熟练练、视视野清晰（910分）基本正确，较较熟练练（68分）
