蛋白质电泳与操作

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1、蛋白质电泳与操作蛋白质电泳与操作福建中医药大学康复医学研究所福建中医药大学康复医学研究所林炜林炜 博士博士2012.4.132012.4.13QuestionsQuestions： 什么是氨基酸？什么是氨基酸？ 氨基酸有何结构特点？氨基酸有何结构特点？ 什么是肽？什么是肽？ 肽是如何形成的？肽是如何形成的？ 形成肽的化学键是什么？形成肽的化学键是什么？ 什么是蛋白质？什么是蛋白质？ 蛋白质的结构特点是什么？蛋白质的结构特点是什么？蛋白质特性蛋白质特性氨基酸（氨基酸（amino acidamino acid） 含有一个碱性氨基和一个含有一个碱性氨基和一个酸性羧基酸性羧基的有机化的有机化 合物。是

2、蛋白质的基本组成单位。合物。是蛋白质的基本组成单位。氨基酸的酸碱性质氨基酸的酸碱性质 氨基酸在水溶液或结晶内基本上均以兼性离氨基酸在水溶液或结晶内基本上均以兼性离 子或偶极离子的形式存在。子或偶极离子的形式存在。 兼性离子兼性离子：又称为两性离子是指在同一个氨又称为两性离子是指在同一个氨 基酸分子上带有能释放出质子的基酸分子上带有能释放出质子的NH3+NH3+正离子正离子 和能接受质子的和能接受质子的COO-COO-负离子，因此氨基酸是负离子，因此氨基酸是 两性电解质。两性电解质。 氨基酸的等电点氨基酸的等电点：氨基酸的带电状况取决于氨基酸的带电状况取决于 所处环境的所处环境的PHPH值，改变

3、值，改变PHPH值可以使氨基酸带值可以使氨基酸带 正电荷或负电荷，也可使它处于正负电荷数正电荷或负电荷，也可使它处于正负电荷数 相等，即净电荷为零的两性离子状态。使氨相等，即净电荷为零的两性离子状态。使氨 基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的基酸所带正负电荷数相等即净电荷为零时的 溶液溶液pHpH值称为该氨基酸的等电点值称为该氨基酸的等电点（isoelectricisoelectric pointpoint）。）。多肽多肽（polypeptidepolypeptide） 一个氨基酸的羟基与另一个氨基酸的羧基脱水缩合形成肽键（一个氨基酸的羟基与另一个氨基酸的羧基脱水缩合形成肽键（ peptid

4、e bondpeptide bond）。）。 通常由通常由10-10010-100个氨基酸分子个氨基酸分子脱水缩脱水缩 合合而成的化合物叫而成的化合物叫多肽，多肽，它们的分它们的分 子量低于子量低于10,000Da10,000Da（DaltonDalton）. .也也 有文献把由有文献把由2-102-10个氨基酸组成的肽个氨基酸组成的肽 称为寡肽（称为寡肽（小分子小分子肽）；肽）；10-5010-50个个 氨基酸组成的肽称为多肽；由氨基酸组成的肽称为多肽；由5050个个 以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白以上的氨基酸组成的肽就称为蛋白 质。质。 蛋白质特性蛋白质特性蛋白质结构一级结构一级结构（pr

5、imary structureprimary structure）氨基酸之间以肽键形成的肽链中氨氨基酸之间以肽键形成的肽链中氨 基酸的排列顺序。基酸的排列顺序。二级结构二级结构（secondary structuresecondary structure） 蛋白质分子中多肽链沿一定方向盘蛋白质分子中多肽链沿一定方向盘 绕和折叠的方式。绕和折叠的方式。三级结构三级结构（tertiary structuretertiary structure） 蛋白质的二级结构基础上借助各种蛋白质的二级结构基础上借助各种 次级键卷曲折叠成特定的球状分子次级键卷曲折叠成特定的球状分子 结构的空间构象。结构的空间构象

6、。 四级结构四级结构（quaternary structurequaternary structure ） 多亚基蛋白质多亚基蛋白质分子分子中各个具有三级中各个具有三级 结构的多肽链，以适当的方式聚合结构的多肽链，以适当的方式聚合 所形成的蛋白质的三维结构。所形成的蛋白质的三维结构。关于电泳关于电泳 电泳（电泳（ElectrophoresisElectrophoresis）：）：是指是指 带电荷的粒子或分子在电场中带电荷的粒子或分子在电场中 移动的现象。移动的现象。 电泳技术：电泳技术：利用带电粒子或者利用带电粒子或者 分子在电场中移动速度不同而分子在电场中移动速度不同而 达到对粒子或分子进行

7、分离的达到对粒子或分子进行分离的 技术。技术。电泳的相关参数电泳的相关参数 电荷：电荷：粒子或分子的电荷性质决定其在电场中的迁移方粒子或分子的电荷性质决定其在电场中的迁移方 向。向。 分子大小：分子大小：分子大小决定了在特定电场强度下一定时间分子大小决定了在特定电场强度下一定时间 内分子在介质中的迁移距离。内分子在介质中的迁移距离。 电场强度：电场强度：电场强度决定了带电粒子或分子在电场中的电场强度决定了带电粒子或分子在电场中的 迁移速度。迁移速度。 介质密度：介质密度：介质密度决定了特定分子在其中的迁移距离介质密度决定了特定分子在其中的迁移距离 ，因此决定其对不同分子的分辨能力。，因此决定其

8、对不同分子的分辨能力。聚丙烯凝胶电泳聚丙烯凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel，PAG）丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵， TEMED等)作用下形成的凝胶。凝胶孔径大小可以通过制备时所使用 的浓度和交联度控制。聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis ，PAGE）利用聚丙烯酰胺形成的凝胶对大分子生物物质（如核酸、蛋白 质）通过附加电场使分子不同的按照分子量大小在凝胶中得到分离 。蛋白质的聚丙烯凝胶电泳类型：按蛋白质变性与否分为变性电泳和非变性电泳；按凝胶浓度梯度分为不连续电泳与连续电泳；按电泳的向性分

9、为单向电泳与双向电泳。蛋白质变性电泳蛋白质变性电泳 蛋白质变性蛋白质变性：蛋白质的三级结构和四级结构的结合力主要是半胱氨蛋白质的三级结构和四级结构的结合力主要是半胱氨 酸之间形成的二硫键酸之间形成的二硫键（Disulfide Disulfide bondbond）。）。而蛋白质三级结构和四级而蛋白质三级结构和四级 结构是蛋白质的功能基础。蛋白质变性就是使二硫键打开，从而使结构是蛋白质的功能基础。蛋白质变性就是使二硫键打开，从而使 蛋白质亚基解离和三级结构打开，使蛋白质失去生物活性，故称变蛋白质亚基解离和三级结构打开，使蛋白质失去生物活性，故称变 性性（denaturedenature）。）。

10、蛋白质变性的方法：蛋白质变性的方法：9595加热加热5 5分钟足以破坏蛋白质中的二硫键，分钟足以破坏蛋白质中的二硫键， 但是当温度降至常温后，二硫键能够重新形成，这个过程称为复性但是当温度降至常温后，二硫键能够重新形成，这个过程称为复性 （renaturerenature）。）。为了使变性后的蛋白不再复性通常使用为了使变性后的蛋白不再复性通常使用- -巯基乙醇巯基乙醇 （2-Mercaptoethanol 2-Mercaptoethanol ）或二硫苏糖醇）或二硫苏糖醇 （DithiothreitolDithiothreitol ，DTTDTT）保护）保护 自由的半胱氨酸巯基。另外，为了避免复

11、性，通常在加热后立即放自由的半胱氨酸巯基。另外，为了避免复性，通常在加热后立即放 入冰浴以减少蛋白质复性的机会。入冰浴以减少蛋白质复性的机会。 蛋白质变性电泳的方法：蛋白质变性电泳的方法：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ sodium sodium dodecyl dodecyl sulfate sulfate polyacrylamide polyacrylamide gel gel electrophoresiselectrophoresis，SDS-PAGESDS-PAGE ） SDS-PAGESDS-PAGE原理：原理：蛋白质在凝胶中的迁移率主要取决

12、于分子大蛋白质在凝胶中的迁移率主要取决于分子大 小、形状以及所带电荷多少。小、形状以及所带电荷多少。SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，在聚丙烯酰胺是一种阴离子表面活性剂，在聚丙烯酰胺 凝胶系统中，加入一定量的凝胶系统中，加入一定量的SDSSDS能使蛋白质的氢键能使蛋白质的氢键 和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（达到饱和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（达到饱 和的状态下，每克多肽可结合和的状态下，每克多肽可结合1.4g 1.4g SDSSDS），使各），使各 种蛋白质种蛋白质SDSSDS复合物都带上相同密度的负电荷，复合物都带上相同密度的负电荷， 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从

13、其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从 而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此 时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分 子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎 可以忽略不计。可以忽略不计。当分子量在当分子量在15KD15KD到到200KD200KD之间时，蛋白质的迁之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合公式：移率和分子量的对数呈线性关系，符合公式： logMWlogMW=K-=K-bXbX，式中：，式中：MWMW为分子量，为分子量，X X

14、为迁移率，为迁移率，k k 、b b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁 移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线， 未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电 泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS-PAGESDS-PAGE操作程序操作程序 蛋白质样品制备蛋白质样品制备 凝胶制备凝胶制备 样品上样样品上样 电泳电泳 凝胶染色凝胶染色 电泳结果分析电泳结果分析来自培养细胞的样品：来自培养细胞的样品： 1.1.悬浮培养细胞：悬浮培

15、养细胞： 2.2. 细胞清洗：对培养基中的悬浮细胞吹打混匀后移至细胞清洗：对培养基中的悬浮细胞吹打混匀后移至15mlV15mlV型底离心管型底离心管 ，台式冷冻离心机，台式冷冻离心机1000rpm1000rpm（300G300G）4 4离心离心5min5min使细胞沉积在离心管使细胞沉积在离心管 底部，弃去培养液。加底部，弃去培养液。加10ml10ml冰浴预冷的冰浴预冷的PBSPBS重新吹打混匀细胞后重新吹打混匀细胞后1000rpm1000rpm （300G300G）离心）离心5min5min，弃去，弃去PBSPBS。重复此步骤三次。在最后一次清洗前对。重复此步骤三次。在最后一次清洗前对 充分

16、吹打混匀的细胞进行计数。充分吹打混匀的细胞进行计数。 2.2.贴壁培养细胞：贴壁培养细胞： 1.1. 细胞消化：吸弃细胞培养瓶中的培养液，并用适量预冷细胞消化：吸弃细胞培养瓶中的培养液，并用适量预冷PBSPBS漂洗一次漂洗一次 ，加适量（足以覆盖细胞）胰酶细胞消化液，加适量（足以覆盖细胞）胰酶细胞消化液( (TrypsinTrypsin-EDTA -EDTA SolutionSolution， 0.25% 0.25% TrypsinTrypsin和和0.02% 0.02% EDTA EDTA ) )，室温消化，室温消化1 15min5min。加。加5ml5ml含含5%5%血清的培血清的培 养基停止消化，吹打使细胞成为单细胞悬液。移至养基停止消化，吹打使细胞成为单