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1、 高效液相色谱样品前处理技术n在做样品之前首先要知道样品大致情况是纯品还 是粗品，如果是粗品是哪一类的原料。n要了解待测组份的性质和化学结构，才能够为样 品的前处理和色谱条件的选择打基础。n上机分析之前 ，准备好样品、选择好色谱条件、 保证仪器正常运行。n注：样品在上机分析之前一定要过滤流动相要过滤、脱气n在复杂基体中低浓度有机化合物的分离和测定是 分析化学所面临的一个挑战虽然分析仪器的自 动化程度日益提高，但在发展分析方法的同时， 人们或多或少忽视了样品的预处理问题。n然而在分析复杂样品，如生物样品、环境样品、 植物样品等，为了获得比较可靠的鉴定结果,必须 花费很多的人力和经费，并且由于前处
2、理步骤多 ，如果前处理不当，往往会使全过程的回收率降 低，会发生定性定量错误和色谱柱寿命缩短等问 题因此，提高和掌握样品的前处理技术是完善 检测全过程的重要环节。n目前仍沿用溶剂提取、色谱分离或液-液分配等纯 化方法。样品预处理的内容繁多，如n液体样品：直接上机、稀释、富集、抽提、离心、 过滤后上 机n固体样品：溶解、离心、萃取n生物样品（如，血液、尿液、动物组织及器官等 样品）：预处理一般说来，样品预处理要达到的目标如下：1去除基体中干扰样品分析的杂质，提高 分析精度和分离效果；2提高被测定化合物检测灵敏度；3提高样品与流动相的兼容性，从而改善 定性定量分析的重复性n 高效液相色谱分析样品时
3、没有统一的前处 理方法。必须根据样品的种类和待测项目决 定前处理方案，但原则上仍应考虑几下操作 环节：n如取样、试样的调制、提取、纯化、浓缩等 步骤，n至于各种具体样品的前处理可以进一步参考 有关资料。（一）取样与调制固体块状样品的取样与调制n为了得到较为可靠的结果，取样的代表性极为重要 。一般取样操作要点可概括为：n第一步随机抽样，抽样量要根据样品数量而定，n第二步再按四分法将试样缩分到所需的量，n第三步再取所需的量。样品得到后必须进行粉碎和 混匀，n小量样品可以使用研钵，较多的试样可使用电动粉碎机粉碎。粉碎后，应通过20一30目筛孔用筛过 筛，混合均匀，制得试样。n当试样含水分较多而较难粉
4、碎时，特别是待分析的成分不会因干燥而发生变 化时，需进行予干燥。一般将已粉碎的试样置于60烘箱中烘12小时，称 取干燥前后的重量，分析维生素类的物质时通常不进行予干燥。n当待测成分会因干燥而分解时，只能将原样进行研磨，或加适量溶液研磨， 使其成为均匀的分析试样。水果等样品可使用研钵。n鱼肉等样先用小刀切成小块后，用绞肉机绞碎。n水果糖等样，能简单溶于水或适当的溶剂，可制成溶液，搅拌匀。n油脂类也能一次性溶解，使其成为溶液、混匀。n牛奶等，因比重不同，溶液上下不均匀，这时可将玻璃管插到底部，在所有 的层次取样，或者用搅拌棒搅匀，取其搅匀的样品。n啤酒、汽水等含碳酸的饮料，在20一25度加热，完全
5、逐出碳酸后再进行分析 。n贝壳类除去壳，仅将贝肉磨碎。n干鱼可直接粉碎制备试样。（二）提取方法提取方法：n液-液萃取n液-固萃取n超声波萃取n微波萃取n膜技术：微渗透超滤膜技术n从技术角度而言植物及食品样品分析最为困难的是 ：待测成分从样品基体中将其分离。n目前，常用的提取分离方法仍采用溶剂提取法n选择提取溶剂时，应考虑到：1、提取溶剂是否会与待测成分发生反应；2、欲分析物质的极性；3、欲分析物质在不同溶剂中的溶解性；4、欲提取样品的类型(含水多、含油多、干材等）；5、溶剂的毒性；6、溶剂的挥发性7、溶剂的纯度；8、溶剂的价格等。n一般亲水性溶剂应用于提取亲水性化物，n而疏水性溶剂最适宜提取脂
6、溶性和油溶性化台 物。n欲分析物质在溶剂中的溶解度是选择最适宜溶 剂时的另一个重要因素。n不同类型的样品需要不同的溶剂。一般用水溶 性溶剂提取含水量高的样品。n而用乙腈提取脂溶性或油溶性样品。n氯仿和二氯甲烷是提取干性材料的最适宜溶剂 。n如果有多种溶剂都适用于提取，那么应该首先 选用毒性最小的溶剂以保护分析人员的身体健 康。 n在控制监测中，当被测成份和样品类型已知时 ，理论上可选择最合适的溶剂。n根据样品类型和被测成份种类使用不同方法进 行提取。n在实际工作中最广泛使用的提取溶剂有：二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、乙酸乙脂、苯、乙醇、甲醇、石油醚、已烷等或它们的混合剂。n在此基础上可以得知有广
7、泛适用性的使用方案 (溶剂样品化合物基体)1、液液分配法提取样品n。n采用液液分配法可把不同溶解度的化合物 分开。正确选择萃取溶剂即可把被测成份萃 取出来，使其与大多数共萃物分开，n色谱分离情况与样品大小有关。随着样品大 小增加，分离情况变差，n因此样品大小无限度地增加会使分配系数和 分离效率降低。n液-液萃取最早被用于样品的预处理，这一方法可 把有机化合物直接萃取到与水不相溶的有机相中， 在一定温度下，溶质在两种互不相溶的溶剂分配时 ，平衡浓度之比为一常数，这一常数称为分配常数 。n只有中性分子才能被萃取，两相中溶质总浓度之比 为分配系数，溶质在两相中的分配系数与选用的萃 取溶剂、水相的pH
8、和有机溶剂与水相的体积比值相 关。n液-液萃取尽可能选用溶质有较大溶解度的有机溶 剂，如果溶质的萃取回收率较低，可通过连续多次 萃取提高回收率，通常采用过量的有机溶剂来萃取 ，以节省时间。1.1、萃取溶剂的选择n被测化合物的相对疏水性将决定萃取溶剂的选择，用于液 -液萃取的有机溶剂必须满足：（1）沸点低，以便可以在 完成液-液萃取后很快可将有机溶剂挥发；（2）溶剂的粘 度低，以使与样品基本相混合，n下表是按溶剂极性排序的一些常用液-液萃取溶剂，n表中有机溶剂在水中的溶解度是一个重要的因素，溶剂在 水中的溶解度对萃取液中的共萃取干扰物质的含量有重要 的影响，一般来说，萃取的有机溶剂极性越小，萃取
9、的选 择性越好，n因此，选择液-液萃取的有机溶剂在能溶解样品的前提下 ，极性应尽可能低。表：一些常用液-液萃取有机溶剂的物理化学性质溶剂剂沸点（）溶剂剂极性（）在水中的溶解度（ %）正己烷烷690001环环己烷烷810001氯氯仿6144082二氯氯甲烷烷4034130乙醚醚35604乙酸乙酯酯77438081.2 pH值的控制液-液萃取所采用的pH值应使被萃取的样品的萃取的有机溶 剂（如乙酸乙酯）具有良好的稳定性，为了使萃取过程有良 好的回收率，应当调节水相的pH使溶质以中性状态存在，如 有机酸为例，其在水相和有机相的分配过程存在以下平衡：HL HL0 H+L- HL有实验表明，一元羧酸在水
10、相的pH值低于3.0时可以很好地 被萃取到有机相中，而当pH值大于5.0时，则主要溶解在水 相中，很难被有机相萃取，利用pH值对分配系数的影响，可 以将有机酸或有机碱从水相萃取到有机相中，反之可以把有 机相中的弱酸、弱碱萃取到水相中， 1.3液-液萃取其他操作因素的控制n液-液萃取并不能对所有的化合物。n强极性化合物取得良好的萃取，如有机 酸或有机碱，可以在水相中加入适当的 反电荷离子对试剂，达到液-液萃取强 有机酸或有机碱的目的，又如金属离子 ，通过在水相中加入鳌和剂与金属离子 形成疏水性的络合物达到萃取金属离子 的效果。（二）液-固萃取n 液-液萃取有许多局限，如：n需要大量互不相溶的溶剂
11、；n样品处理步骤复杂；n样品回收率和重复性不理想；n处理过程中乳状液的生成；n溶剂蒸发时，样品降解所至的样品损失。n液-固萃取方法采取高效、高选择性的固定相，n液-固萃取主要用于样品分析前净化和或富集，n净化操作是样品分析中最重要的步骤之一。n因为在提取操作之后，提取物中既有被测成份又有别的干扰物或共萃物。这些物质可由下列化合物组成：探发性物质、胺类、酚类、有机酸类糖类、油脂、叶绿素和其他有色物质等。净化方法中的一些问题n提取液在净化前，必须对待测化合物的一些 重要的物理性质有所了解，如在有机溶剂和 水中的溶解性；酸性；稳定性；蒸气压；熔 点，沸点，极性。nSEPPAK预处理柱-应用于样品的纯
12、化及痕 量浓缩等方面。固相萃取的影响因素n固相萃取一般有四个基本步骤：固定相活化；样品上柱；淋洗；分析物洗脱 。n活化的目的是创造一个与样品溶剂相溶的环 境并除去柱内所有的杂质，通常需要两种溶 剂来完成，第一个溶剂（初溶剂）用于净化 固定相，第二个溶剂（终溶剂）用于建立一 个合适的固定相环境使样品分析物得到适当 的保留。n每一活化溶剂用量约12ml/100mg固定相。n除去杂质的最好方法是用初溶剂洗柱，初溶剂应 该与洗脱溶剂一样强或强与洗脱溶剂，这样就可 以除去所有可能与分析物一起洗出的物质。终溶 剂不应强与样品溶剂，若使用太强的溶剂，将降 低回收率，通常采用的终溶剂要比样品溶液弱。 理想的终
13、溶剂应该与样品溶剂性质相似，例如， 一个水样被HCI调节到pH2，终溶剂（水）也应用 HCI调节到pH2。n值得注意的是，在活化过程中和结束时，固定相 都不能抽干，因为这样可导致填料床出现裂缝， 使回收率降低、重复性差，样品也没有得到应有 的净化，如果在活化步骤中出现干裂，所有的活 化步骤都得重复。淋洗n分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗 掉不需要的样品组分;n淋洗溶剂的洗脱强度是略强于或等于上样溶剂 ，淋洗溶剂必须尽量地弱，以洗掉多的干扰组 分，但不能强到可以把所有分析物都洗掉的程 度;n溶剂的体积为0.5-0.8mL/100mg固定相，n淋洗步骤也能确保粘壁在样品都进入固定相。洗脱n
14、淋洗后再将分析物从固定相上洗脱下来。洗脱溶剂的体积为 0.5-0.8mL/100mg固定相，溶剂必须认真选择。溶剂太强，一 些不要的组分将被洗出来，溶剂太弱，就需要更多的洗脱液。n在溶剂选择上还有几点值得注意，有时在上样、淋洗和洗脱时 一个溶剂太强，另一个溶剂太弱，可以把两者混合，通过改变 它们的比例来满足要求。n另一值得注意的问题是溶剂的互溶性，后一种流过柱床的溶剂 必须与前一溶剂互溶。n有时候固体样品必须用一个很强的溶剂萃取，这样的萃取液是 不能直接上样，所以萃取液要用一个弱溶剂稀释以得到一个合 适的溶剂强度进行上样，例如，一个土壤样品，采用50%的甲 醇萃取，得到2 mL 萃取液，用8mL 水稀释，得到10%的甲醇溶 液，这样就可以直接上反相固相萃取柱而不出现穿漏的现象。浓缩n为了提高被测物在溶液中的浓度，提高检出率， 提取液经纯化以后均进行蒸发浓缩。n目前最常用的浓缩方法：把经过纯化后的溶液转 移至园底烧瓶内，用旋转蒸发器在一定温度的水 浴中减压浓缩至一定量，经每分钟5000转的离心 机离心5分钟，取上清液液用于液相分析，也可用 0.45m滤膜过滤，滤液即可用于分析。n柱层析法除了纯化样品的作用外，尚可将被测物 吸附浓缩。建立高效液相色谱分析方法的一般步骤n 食品中多环芳烃
