分子生物学实验原理

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1、分子生物学实验原理第一节 分子生物学发展概述l分子生物学molecular biology是在分子水平上 研究生物的结构、组织和功能的科学。l1950年，Astbury在一次学术报告中，首 次提出并使用了分子生物学这一名词术语。l广义和狭义之分l医学分子生物学是应用分子生物学技术和 理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及 其调控的分子机理。分子生物学理论与实际应用的成就理论方面1.关于肿瘤的发生： 提出了肿瘤起源于细胞增 殖和分化调控的失常和细胞同它周围组织关系 的紊乱。 癌基因：100多种；抑癌基因：20多种 细胞周期调控系统 细胞凋亡 端粒酶2.关于艾滋病 Acquired Immune

2、Deficiency SyndromeHIV序列；疫苗3.关于慢性病chronic disease，如心血管疾 病、肥胖、糖尿病、骨质疏松，发现了 相关基因及其多态性。4.关于生长、发育与进化的统一理论， 也深入到了分子水平。实际应用方面1.转基因植物目前已鉴定和克隆化的用于转基因植 物的基因有100多个。抗除草剂、抗昆虫、抗病毒、抗不良 环境因素（抗寒、抗盐碱地、抗旱、 抗涝）、提高作物的产量、提高蛋白 质含量、改善氨基酸构成等。2.转基因动物1983年，超级小白鼠，体重是正常鼠的2 倍。随后出现转基因猪、羊、鸡、兔、牛 、鲤鱼等。我国目前研究了金鱼、鲤鱼、 圆头鲂。3.基因工程多肽药物与疫

3、苗主要指DNA体外重组技术所研制的产品， 转基因动物和植物所研制的产品，以及蛋 白质工程技术所研制或改进的产品。4.基因诊断与基因治疗基因诊断gene diagnosis是指通过直接探查基 因的存在状态或缺陷，从而对疾病作出诊断 的方法。目的物：DNA或RNA方法：核酸分子杂交技术、PCR技术、DNA芯片技术疾病：遗传性疾病；传染病或感染性疾病基因治疗gene therapy指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内 ，以弥补所缺失的基因，关闭或降低异常 表达的基因，以达到治疗疾病的目的。治疗疾病：遗传病恶性肿瘤传染病5.环境监测与净化 area survey and depollution监测：可

4、检测环境中的病毒和细菌净化：改造细菌分解环境中的石油、残留的农药 和有毒金属6.克隆动物Clone animal1997年“多利”克隆羊克隆器官（干细胞stem cell技术）7.人类基因组计划human genome project;HGP1990年，美国国立卫生研究院（NIH） 和美国 能源部联合发表了人类基因组计划。30亿个碱基对，估计有3万4万个人类基因。2000年6月26日，首次绘成人类基因组“工作框 架图” 。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英等6 国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制 成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。 意 义与“阿波罗”登月计划相媲美1996

5、年诺贝尔化学奖得主罗伯特柯特认为 ，20世纪是物理学和化学的世纪，21世纪 将是生物学的世纪。推动分子生物学更加快速地发展：蛋白质 组学、代谢蛋白质组学、药物蛋白质组学 、毒物蛋白质组学、营养蛋白质组学及各 种计划对其他相关学科的影响1.向其他学科渗透2.形成了许多新兴的边缘学科基础医学方面：肿瘤分子生物学、免疫分子生 物学、神经分子生物学等预防医学方面：分子营养学、分子毒理学、分子流行病学、遗传流行病学、人类基因组流行病学、 公共卫生遗传学在预防医学中的应用及发展方向1.慢性病的研究 慢性病的发病原因绝 大多数是基因与外界环境因素相互作用 的结果。 2.环境因素对人类遗传物质损伤的研究及 “

6、三致”毒性的研究：生物标志物的研究 和评价方法的建立 3.环境监测与污染物的净化。4.遗传病的产前诊断（基因型预防）及早期诊 断（表型预防）。5.某些重要疾病的生物工程疫苗的研制。 6.对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境 基因组计划（环境基因组学）（1）环境应答反应基因（2）筛选多态性及易感性（3）根据易感性制定不同的干预计划一、分子生物学一些重要的理论知识1.分子生物学发展史上一些重要的事件（1）1865年，“遗传学之父”G.Mendel根据豌 豆杂交试验结果，创立了遗传因子学说，即遗 传的分离律和自由组合律。（2）1903年W.Sutton提出染色体是Mendel遗 传单位的载体的概念

7、。（3）1909年，W.Johannsen将这种在染色体 上的遗传单位定名为基因（gene）。（4）1910年，现代实验遗传学奠基人 TH.Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗 传规律时发现了基因的连锁律和交换律。（5）1944年，OT.Avery等人（3人）分离 出细菌 DNA，并发现DNA是携带生命遗传 物质的分子。（6）1950年，Astbury在一次演讲中，首次 使用了 “分子生物学” 术语。 （7）1953年，Watson和Crick提出了DNA 结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复 制的机制。（8）1961年至1966年，Nirenberg和Crick 等人破译了DNA遗传密码

8、，1966年 破译了 64个遗传密码。提出了遗传信息由DNA RNA蛋白 质传递的中心法则。 （9）1969年，Jonathan Beckwith及其同 事在哈佛大学成功分离出第一个基因。（10）1970年，发现了逆转录酶。 （11）1961年，F.Jacob和J.Monod提出了 乳糖操纵子学说。（12）自1946年起的20年当中，陆续发现 了许多质粒；1968年至1970年又发现了许 多限制性内切酶，为DNA体外重组提供了 有利工具。（13）1973年，重组DNA技术问世。（14）1986年，K.Mullis等建立了PCR技术（15）1990年，人类基因组计划。2.三个重要理论import

9、ant theory(1)DNA的结构、复制、中心法则 基本构成单位是核苷酸 核苷酸由脱氧核糖、碱基和磷酸构成。 碱基分别是腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤 (G)、胸 腺嘧啶 (T)和胞嘧啶(C)。 相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连 进一步盘旋、折叠，形成三级或四级结构RNA与DNA有如下不同点：u五碳糖为核糖(不是脱氧核糖)；u碱基中有尿嘧啶U(uracil)而没有胸腺嘧 啶uRNA为单链，不是双链，但RNA单链之间 相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链。 uDNA存在于细胞核的染色体、线粒体以及 染色体以外的质粒中(质粒是一些双链，闭 环的DNA分子)。DNA(或RNA) 结构给我们的启示DNA(或

10、RNA)是水溶性的。这是由于含有 磷酸基因、羟基和氨基。在核酸提取过程 中，我们保留的是水相、而不是有机相。核酸是两性电离，既带正电荷，又带负 电荷。它的等电点(PI)为22.5。在中性 溶液中带负电荷。对核酸进行电泳时，点 样时应点在负极；杂交时选择尼龙膜时， 最好选择带正电荷的尼龙膜。(核酸带负电荷 ，容易吸附到带正电荷的膜上，牢固，不掉) DNA在细胞中存在部位不同(细胞核、线粒 体、质粒)，所以应注意提取方法的不同 由于DNA空间构象不同，在电泳时迁移率 不同。根据碱基互补配对原则，可设计引物和探 针杂交。由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内 氢链作用形成二级结构，所以在进行杂交

11、等 反应时，首先应加热变性，破坏二级结构。l 在解旋酶的作用下，打开DNA双链 l 在特定的复制起始点l 以每条DNA链为模板l 在DNA聚合酶的催化下l 以4种脱氧核苷酸为前体物，合成 一条互补DNA链。DNA的复制双称为半保留复制。DNA的复制DNA DNA 半半保保留留复复制制DNA在复制起始点，由解旋酶打开双链， 形成复制叉，合成新链的方向为5-3端前导链与后随链后随链的合成是不连续的。 先合成RNA引物 再合成不连续的小片段(冈崎片段，100 1000核苷酸长度) 最后在DNA连接酶作用下，将小片段连 接起，形成完整的DNA链。 DNA 半 不 连 续 复 制DNA的复制给了我们一些

12、启示 PCR技术的原理：在体外要靠温度(90 以上)打双链，而不是解旋酶，也是以DNA为 模，需要引物，需DNA聚合酶，需要dNTP为 前体。PCR与体内(细胞内)DNA复制的最大差 异是温度。检测核分裂指数：在细胞培养中，加入3H 标记的dNTP前体物，被细胞摄取后，参与 DNA复制，复制速度越快，参入的3H标记的 dNTP越多，可用液闪计数仪检测放射性强度 ，据此判断。p遗传信息的传递是：DNARNA多肽(蛋白质)p在逆转录酶的作用下，RNA可形成cDNA ，然后再由RNA蛋白质以上就是完整的中心法则理论，亦可称 为基因的表达(expression)。中心法则中 心 法 则转录(trans

13、cription) 以DNA为模板，合成RNA的过程。非模板链称为有意义链，而模板常称为反义链。转录的过程大致是这样的：u 以DNA一条链为模板，u 诱导RNA聚合酶活性、RNA聚合酶识别并结合在 转录起始位点u 以ATP、GTP、CTP和UTP为前体，合成(转录)RNAu 当遇到转录终止信号时，转录即停止。有意义链反义链 转录后的初级产物剪切掉内含子，并将外显 子连接起来，这样才能变成成熟的RNA分子 还需要在5-端加一个特殊的核苷酸，7-甲 基鸟嘌呤核苷酸，这个过程叫戴帽 另外，mRNA的，这一过程又叫穿靴， 3-端 还要加上一串腺苷酸(AMP)poly(A)或多聚腺苷 酸化。 同一机体不

14、同的细胞具有相同的DNA或基因， 但基因在不同细胞的表达是不同的，具有组织 特异性，使不同的细胞具有不同的功能 由RNA 蛋白质的过程，又叫翻译。只有聚合酶 II催化的反应产物是mRNA，而只有mRNA才翻译成 蛋白质。 基因(DNA)上三个相邻的碱基组成一个密码子， 一个密码子决定一种特定的氨基酸，共有43=64个 密码子。 在转录过程中，基因上的三联密码子转录成mRNA 上的三联密码子。 mRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上，以三联 密码子指导合成蛋白质。 翻译后的蛋白质需要加工修饰。 中心法则给了我们一些启示：遗传信息由DNA上的基因决定。一旦基 因发生突变，将最终导致所翻译的蛋白质

15、发生改变，从而导致生理功能改变，甚至 出现疾病，如癌症、肥胖等。 mRNA更能准确简便地反映DNA上基因所 携带的遗传信息。因此对基因序列的分析 ，常分析mRNA的序列即可。基因的表达有组织特异性，且受许多因 素的影响，使mRNA的表达增强、降低甚至 关闭，从而影响机体正常生理功能，甚至 出现疾病。因此常需要检测mRNA的表达的丰度(含量) ，常用方法有Northernblot、RT-PCR。定 量(Real time)PCR等。这里需要特别强调：在检测mRNA(或蛋白) 表达时，一定要先弄清该基因在某种组织 中是否有表达。根据中心法则，可以RNA为模板，在逆 转录酶作用下形成cDNA，于是建

16、立了RT- PCR的方法。 根据mRNA的3端有poly(A)的特点，在 进行反转录时，就以poly(A)为模板设计 了引物。并且纯化mRNA的方法，也是根据 poly(A)的原理设计的。根据最后的翻译蛋白质去向的不同，建 立不同的蛋白质提取方法，如在线粒体， 在细胞核、在细胞浆、分泌到血液中。 （2）基因表达调控 以乳糖操纵子学说为例 乳糖操纵子的基本组成元件调节基因 结构基因I P O 抑制基因(I) ：是阻遏物编码区 启动基因(P) ：有cAMP受体蛋白(CRP) 和RNA聚合酶的结合位点 操纵基因(O)：是阻遏物结合位点 ：-半乳糖苷酶结构基因 ：透过酶结构基因 ：转乙酰酶的结构基因调节方式 当乳糖时