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1、 微丝染色及形态观察微丝染色及形态观察目的要求1. 掌握微丝的染色方法。 2. 了解光镜下微丝的基本形态结构。实验原理 真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架(cell skeleton)，在维持细胞形状和运动方面具有重要作用。 根据组成成分和组装结构的不同，可将细胞骨架分为微管 (microtubule, MT)、微丝(microfilament, MF)和中间纤 维(intermediate filament, IF)。微丝普遍存在于多种细胞 ，对细胞的形状和运动有一定作用。当细胞用TritonX-100溶液处理，能够 溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细 胞骨架中的蛋白质却不被破坏，
2、经固定和考 马斯亮蓝（非特异性蛋白质染料）染色后， 胞质背景着色弱，微管等蛋白结构在光镜下 无法分辨，在光镜下观察到主要是由微丝组 成的应力纤维。应力纤维由平行排列的微丝组成，体外 培养的贴壁细胞应力纤维尤为发达，形态长 而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。 微丝在细胞内的分布特征实验用品 器具：CO2恒温培养箱、倒置显微镜、超净 工作台、低速离心机、普通光学显微镜、移 液器、恒温箱、镊子、培养皿、载玻片、盖 玻片、吸水纸。 材料：盖玻片培养的成纤维细胞 试剂：6 mmol/L PBS（pH 6.5）、1 TritonX-100溶液、M-缓冲液、3戊二醛固 定液、0.2考马斯亮蓝染液、DME
3、M培养液 。 实验步骤1. 培养 在成纤维细胞进行传代培养时，将已消 毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培养皿中， 于37、5%CO2的温箱中生长24h48h。 2. 染色处理 （1）取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培养 皿中（正面向上）,用PBS洗3次（从盖玻片一 角轻轻滴加3 4滴），洗去表面的培养液。 （2）抽提 吸弃PBS，加入1% Triton X-100液4 -5滴（刚好覆盖盖玻片表面），室温处理 15min（3）稳定 吸弃Triton X-100，立即用M-缓冲液轻轻 地洗涤3次。（4）固定 略晾干，在3%戊二醛液中固定10min，再 以 PBS液洗3次，洗去固定液。（5）染色 滴
4、加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色10 min，然后小心的用自来水漂洗。（6）观察 留取少量水分封片于载玻片，吸水纸吸去多余的水。光镜下观察临时装片。实验结果 光镜观察，微丝聚集成的应力纤维束 被染成蓝色，成纤维细胞多数有突起 ，微丝沿突起规则排列。光学显微镜下微丝分布图注意事项 1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片 上洗去。 2操作中应注意区分细胞盖玻片的正反 面。 3染色后应冲洗盖玻片背面，避免损伤 细胞。 4TritonX-100抽提蛋白时，注意避免 抽提时间过长而导致细胞结构的破坏。作业与思考题 1. TritonX-100液、M-缓冲液、戊二醛及考 马斯亮蓝在本实验中所起作用？ 2微丝作图.
