抗生素微生物检定法

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1、抗生素微生物检定法HPLC紫外分光光度法化学滴定法效价测定SHSLTH TL前 言抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典 的抗生素效价测定方法。自20世纪40年代建立 至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着 HPLC等化学分析技术的发展，一些抗生素品种 的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下 原因：前 言o 微生物检定法可直观、特异地反映出抗生素 药品的抗菌活性； o 多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的 差异，化学测定结果难以准确表征组分组成 、含量和生物活性间的关系； o 许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当 的化学分析方法表征其活性。所以抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍 占有

2、重要地位，且短期内化学分析法不可能取 代微生物检定法。1定义抗生素微生物检定法o 抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度 下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生 素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效 成分效力的方法。1定义抗生素青霉素“抗生素是微生物在代谢中产生的具有抑制它种微生 物生长活动、甚至杀灭他种微生物的化学物质”。“是在低微浓度即可对某些生物的生命活性有特异抑 制作用的微生物次级代谢产物及其衍生物 ”“抗生素是生物（包括微生物、植物、动物在内）在其生命 活动中产生的（或并用化学、生物或生化方法衍生的），能 在低微浓度下有选择地抑制或影响它种生物机能的化学物质 的总称。” 由生

3、物发酵改为化学合成（氯霉素）、全新结构的全合成抗生素（氨曲南）抗肿瘤、抗寄生虫等抗生素的不断发现 、化学改造推 动半合成抗生素的迅速发展 定义为1942年，链霉素的发现者Waksman定义：1929 年Flemming发现第一种抗生素（ ）1.定义抗菌活性o 抗菌活性是指抗菌药物抑制或杀死病原微生 物的能力。 o 抗生素的抗菌活性通常用效价单位来表示。o 在临床应用中，抗生素的抗菌活性可准确地 反映抗生素的医疗价值。 硫酸链霉素 798单位/毫克青霉素G钠 1670单位/毫克杆菌肽 74单位/毫克1.定义抗生素效价定义o “活性”重量单位o 重量折算单位o 特定单位1.定义抗生素效价定义l “

4、活性”重量单位：以抗生素中所含特定的抗 菌（抗肿瘤细胞、抗病毒）活性部分的重量 作为效价单位。 o 如碱性抗生素，以纯碱的量作为有效部分的 量；酸性抗生素，以纯酸的量作为有效部分 的量。1.定义抗生素效价定义o 在抗生素的生产、研究和应用等方面，均以 抗生素活性成分的“活性”重量计量抗生素的 效价单位，采用活性成分的“活性”重量1g1效价单位的方法表示。o 抗生素效价以“单位（u）”或“微克（g ）”表示。 1.定义抗生素效价定义例：硫酸链霉素o 抗菌活性是以链霉素效价单位表示的，其链霉素的效价单位是以具活性成分链霉素碱的 “活性”重量表示的，即1链霉素效价单位1微克链霉素碱，这里是“活性微克

5、”而不是“重量微克”。1.定义抗生素效价定义o 在制成盐类或其他衍生物后，其相应的折算效价，可以从分子量折算而得。o 如：硫酸链霉素的折算效价为1.定义抗生素效价定义l 重量折算单位：以特定的纯抗生素制品的某 一重量为1单位而加以折算。 o 如：青霉素G钠以青霉素单位也称牛津单位（Oxford unit ）表示其抗菌活性，最初的定义为“1个青霉 素效价单位（u）为能在50毫升肉汤培养基 中完全抑制金黄色葡萄球菌标准菌株发育的 最小青霉素剂量”。1.定义抗生素效价定义o 例：青霉素国际标准品 第一批青霉素国际标准品，青霉素G钠称重0.6微克为1单位，即1667单位/毫克。 第二批青霉素国际标准品

6、，青霉素G钠称重0.5988微克为1单位，即1670单位/毫克。1.定义抗生素效价定义l 特定单位：这一类抗生素大都组成成分较复 杂，或还不易得到纯品，在开始生产及临床 使用时，只能以一特定量的标准品（或对照 品）作为1单位。o 如：杆菌肽国际标准品第一批杆菌肽国际标准品为55单位/毫克；第二批杆菌肽国际标准品为74单位/毫克。1.定义抗生素微生物检定法o 抗生素微生物检定法可分为：（1）稀释法（2）比浊法（3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法） 各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。 1.定义稀释法o 通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，观察含不同浓度抗生素的液

7、体培养基中有无细菌的生长，从而测定抗生素最低抑菌浓度（MIC）的方法，常用于新药研制及临床药敏试验等方面。 1 2 3 4 5 6 7 8 一 一 一 一 一 一 一 一 不同浓度的抗生素液体培养基 浓 稀等量的试验菌菌液1.定义比浊法o 通过监测等量的试验菌菌液在不同浓度的抗生素液体培养基中的生长情况，利用分光光度法测定含不同浓度的抗生素的液体培养基的浊度，从而衡量抗生素抑菌效力的方法，可用于抗生素药物的含量（效价）测定。 1.定义（琼脂）扩散法o 通过测定由不同浓度的抗生素溶液在含有试验菌固体培养基中的扩散，而在其表面所产生的抑菌圈的大小，衡量抗生素抑菌效力的方法，多用于抗生素药物的含量（

8、效价）测定。抗生素微生物检定方法比较： 1.定义管碟法 l 此法系根据抗生素在一定浓度范围内，对数 剂量与抑菌圈直径（面积）呈直线关系而设 计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用， 比较标准品与供试品产生抑菌圈的大小，计 算出供试品的效价。 TH TLSH SL2.原理抑菌圈的形成o 两种互动作用：一种是抗生素溶液向培养基 内呈球面状扩散作用；另一种是试验菌的生 长作用。 o 当培养到一定时间，琼脂培养基中的两种互 动作用达到动态平衡时，琼脂培养基中便形 成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素 浓度高于抑菌浓度，试验菌生长受到抑制， 此处琼脂培养基成透明状；在抑菌圈边缘抗 生素浓度恰好等于抗生素

9、最低抑菌浓度。2.原理量反应平行线原理o 量反应平行线原理：“在属量反应的指标中，当对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条对数剂量和反应关系直线相互平行”。2.原理量反应平行线原理o 在抗生素微生物检定法中，一定剂量范围内，抗生素对数剂量与其所致抑菌圈的大小呈直线关系。这就在理论上决定了，（活性）成分相同的标准品与供试品在一定剂量范围内产生的两条剂量反应直线相互平行，符合量反应平行线原理的基本要求。2.原理量反应直线o 两位微生物学者Hamphrey Light和Brown推导出的琼脂球面扩散动力学公式：o 该方程奠定了管碟法量反应直线公式的基础。o

10、将上述公式简化、移行，并将自然对数转换为常用对数得：o 上述公式表明，抗生素总量的对数(lgM)与所形成的抑菌圈半径的平方(r2)呈直线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗生素抗菌活性物质的量。 3.检定方法o 分类 一剂量法（标准曲线法） 二剂量法（2 2法） 三剂量法（3 3法）o 二剂量法（2 2法）：用标准品、供试品各两个剂量，根据量反应平行线原理，在相同试验条件下 ，比较标准品和供试品二者对微生物产生的效力。 二剂量法用于抗生素药品效价的常规测定；3.1管碟法的操作步骤3.1管碟法的操作步骤预试验试验准备 双碟底层的制备 供试品、标准品溶液的制备菌层的制备滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈

11、的测量结果的可靠性检验及效价测定3.1管碟法的操作步骤o 预试验：确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使 用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈 的大小符合规定：高剂量浓度溶液所致的抑 菌圈直径在1822mm。高剂量与低剂量 的抑菌圈直径之差最好不小于2mm。 高低剂量之比为2:1（如高、低剂量所致的抑 菌圈差别较小时，可用4:1的剂量比率）。3.1管碟法的操作步骤o 试验准备：双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌 ；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲 液的准备、半无菌间的紫外消毒等。3.1管碟法的操作步骤o 双碟底层的制 备：每只双碟加底 层培养基约 20ml，待培养 基凝固，待用 。

12、3.1管碟法的操作步骤o 供试品、标准品溶液的制备：估计供试品的效价，根据试验要求设计供试 品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品 、标准品相关剂量的溶液。3.1管碟法的操作步骤o 菌层的制备：菌层培养基：在培养基 中添加一定量的菌悬液 ，振摇混匀。注意菌层 培养基温度；根据预试 验确定加入菌层培养基 的菌液量。每只双碟加入5ml菌层 培养基。注意制备菌层的速度和 平整度。3.1管碟法的操作步骤o 滴加抗生素溶液： 注意标准品、供试品高、低剂量 溶液滴加顺序，保证滴加速度和加 量的均匀一致。每组双碟至少为8 个，一般为10个。 在每个双碟的4个钢管中，对角的 两个钢管分别滴加高浓度和低浓度 的

13、标准品溶液，其余两个对角位置 的钢管分别滴加相应的高、低浓度 的供试品溶液。 按SHTHSLTL顺序，分别 滴加标准品和供试品高、低剂量溶 液。3.1管碟法的操作步骤o 双碟的培养：根据培养温度 的要求在培养 箱中进行培养 ，培养箱中水 平叠放的双碟 数以不超过三 层为宜。3.1管碟法的操作步骤o 抑菌圈的测量：将培养好的双碟取出，打开陶瓦盖，将钢管 倒入1：1000新洁尔灭溶液或其他消毒液内 浸泡，检查抑菌圈是否圆整，如有破圈或不 圆整圈应将碟弃去，切忌主观挑选抑菌圈和 双碟，是结果造成偏离。抑菌圈测量仪的使用：每组试验双碟应在相 同的测量参数下进行测量。手工测量：游标卡尺3.1管碟法的操作

14、步骤o 结果的可靠性检验及效价测定：抑菌圈测量仪提供计算结果或手工计算结果 。3.1管碟法的操作步骤培养后的双碟3.1结果计算及判断o 可靠性检验 抗生素微生物检定法前提条件是：标准品S 和供试品T各对数剂量与反应呈直线关系， 且标准品S和供试品T的两条直线平行。 可靠性测验是利用生物统计方法验证标准品 和供试品的量反应关系是否显著偏离直线、 偏离平行。对在一定概率水平下不显著偏离 直线、不显著偏离平行的实验结果，认为可 靠，所得检定结果有意义。 3.1结果计算及判断o 以红霉素眼膏为例，红霉素标示量为0.5%， 即每1g红霉素眼膏中含5000u红霉素。假设 投料量为100%，那么估计效价为1

15、00%。试 验采用二剂量法；剂间比为2；浓度比为1； 试验菌为短小芽孢杆菌CMCC（B）63 202 。 3.1结果计算及判断可靠性测验计算：p结论：回归非常显著F27.82（P0.01）(即不显著偏离 直线）；偏离平行不显著F34.26（P0.05）；实验结果 成立。试品间 F1= 0.5326 P=0.05 F= 4.2600 回 归 F2= 873.2370 P=0.01 F= 7.8200 偏离平行F3= 0.2537 P=0.05 F= 4.2600 P0.05剂 间 F6= 291.3411 P=0.01 F= 4.7200 碟 间 F7= 2.1653 P=0.01 F= 3.6700 回归（F2） 表示测验的量反应值是否随剂量而有规律的增加或降低。 回归项变异（P0.05）不显著，则平行关系是可靠的。3.1结果计算及判断抑菌圈测量值： =碟号 ds1 ds2 dt1 dt2 ym -