《实时荧光定量PCR-肖晓秋2010-11-12》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时荧光定量PCR-肖晓秋2010-11-12（52页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)肖晓秋重庆医科大学生命科学研究院讲 座 提 纲q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量技术的应用实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR原理：实时原理常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 ，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时 检测实时定量PCR技术：利用荧
2、光信号的变化实时检测PCR扩增反应 中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标 准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理：实时原理实时荧光定量PCR原理：定量原理介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分 析实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）：q 前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline），即样本的荧光背景值和 阴性对照
3、的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循 环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动设置：原则要大于样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光最高值，同 时要尽量选择进入指数期的最初阶段 ，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR 原理 -Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理实时荧光定量PCR
4、原理 - 定量原理实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越 小q Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标 准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中 所含的模板量qq确定未知样品的确定未知样品的 C(t)C(t)值值 qq通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量25讲 座 提 纲q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定
5、量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用非特异性荧光标记：1、 SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记实时荧光定量PCR 方法 1-SYBR Green 法SYBR Green SYBR Green法 工作机理q SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位q SYBR Green只有和双链DNA结合后才发荧光q 变性时，DNA双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。SYBR Green 实时荧光定量实时
6、荧光定量PCRPCR原理原理 SYBR Green I SYBR Green I 工作原理工作原理5353SGNo Emission SGSGSG ExcitationSGSGSGSGSGSGSG5353EmissionExcitation实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理SYBR Green ISYBR Green I熔解曲线分析熔解曲线分析温度荧光强度TmTmTm值：值：DNADNA解链一半时的温度解链一半时的温度实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理原理SYBR Green ISYBR Green I融解曲线分析融解曲线分析 将温度与荧光强度的变化求导。将温度与荧光强度的变化
7、求导。(- (-dI/dTdI/dT) )-dIdTTmSYBR Green 法 融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确非特异性产 物Cycle numberFlourescenc Ck 102Ck 104SampleCycle numberLog of DNA concentrationSYBR Green 法 定量原理q 模板DNA量越多，荧光达 到域值的循环数越少q Log浓度与循环数呈线性关 系，根据样品Ct值，就可以计 算出样品中所含的模板量SYBR Green 法 -PCR反应的建立反应体系的建立及优化
8、:1.SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太 弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer 体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同SYBR Green 法 应用范围q 起始模板的测定q 基因型的分析q 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBR Green 法 优缺点 q 对DNA模板没有选择性-适用于任何DNAq 使用
9、方便-不必设计复杂探针q 非常灵敏q 便宜优 点q 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件q 对引物特异性要求较高缺 点与目标序列互补实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法TaqMan-水解型杂交探针v 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 v 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)v 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光v Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法 工作原理每扩增一条DNA 分子，释放一个 荧光信号，可以 在循环过程中任 一点检测荧光T
10、aqMan 法 PCR反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定：一般为：94 ，10-20S60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高）也可通过温度梯度优化退火温度72 ，45 S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同TaqMan法 优缺点q 对目标序列的高特异性-阴性结果确定q 设计相对简单-与目标序列某一区域 互补q 重复性比较好优
11、 点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点讲 座 提 纲q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用q 实时荧光定量PCR原理q 实时荧光定量PCR的几种方法介绍q 实时荧光定量PCR实验设计及应用n绝对定量(Absolute Quantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究n相对定量(Relative Quantification，RQ)基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究实时荧光定量PCR法：绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量的定义绝对定量通过标准品定量n绝
12、对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：n含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒n含有和待测样品相同扩增片段的cDNAnPCR的产物绝对定量：从荧光到拷贝数实时荧光定量PCR法:相对定量通过内标定量n内标（Endogenous Control）通常是-actin、 GAPDH基因等看家基因n在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小n内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量实时荧光定量PCR法:相对定量-参照因子 Calibrator实时荧光定量PCR法-相对定量分析方法1:-Ct前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100且偏 差在5以内:
13、1、用内参基因的Ct值归一目标基因的Ct值：Ct（test)= Ct （target,test) - Ct （ref,test) Ct（calibrator)= Ct （target, calibrator) - Ct （ref, calibrator) 2、用校准样本的Ct值归一试验样本的Ct值：Ct= Ct（test) - Ct（calibrator)3、计算表达水平比率：2 Ct=表达量的比值实时荧光定量PCR法-相对定量分析方法2：双标准曲线法 目标基因与内参基因扩增效率不同：待测样品目的基因浓度待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度实时荧光定量PCR法：
14、实验要素1-样品DNA纯度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之间 DNA用量：0.05 ng 100 ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 总RNA反转录的cDNA取 1 uL实时荧光定量PCR法：实验要素2-标准品实时荧光定量PCR法：实验要素2-标准品标准品梯度稀释方法复管测试样品和标准品都要重复 重复次数须遵循统计学要求实时荧光定量PCR法：实验要素3-重复实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例TaqManTaqMan法研究法研究ERBB2 ERBB2 在乳腺肿瘤在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异组织标本中的表达差异TaqMan法举
15、例 标记探针使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量q Fam标记目标基因探针 q VIC标记看家基因探针TaqMan法举例 材料准备q从正常乳腺组织中提取的总 RNA q从乳腺癌组织中提取的 总RNA q含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准 曲线 q单双通道同时进行，独立分析qq ControlsControls no RNAno RNA：阴性对照阴性对照 RNA + no reverse transcriptaseRNA + no reverse transcriptase：基因组对照基因组对照TaqMan法举例 癌症标记物表达Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2TaqMan法举例 实验结果 定量Copies ng/ l Total RNAHealthy RNATumor RNATumor/H ealthyERBB21095 10522130 24922.16 XGAPDH
