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1、第五章第五章 蛋白质的测定蛋白质的测定1 蛋白质的测定方法vpro的测定方法分为两大类：一类是利用pro的共性，即含氮量，肽链和折射率测定pro含量;另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定pro含量。蛋白质用凯氏法测定，因其中尚有氨基酸、酰氨等非蛋白质氮，故称“粗蛋白质”，若用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算成的蛋白质含量，则称为“纯蛋白质”。2测定蛋白质最常用的方法为凯氏定氮法 凯氏定氮法是通过测定出样品中的总氮含量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。经过人们长期的应用和不断改进，凯氏定氮法已演变成常量法、微量法、半微量法、改良凯氏法及自动定氮法等
2、。3v优点： 具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪器等优点。v缺点： 操作较费时(除自动凯氏定氮法外)，单消化过程一般就需要23h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5h以上；在操作过程中会产生大量有害气体。 4l 为满足生产单位对工艺过程快速控制分析，减少环境污染和操作简便省时，后来在凯氏定氮法的基础上又陆续出现了水杨酸比色法、双缩脲法、水合茚三酮法、染料结合法、紫外分光光度法、折光法、旋光法、近红外线光谱法以及测定开氏消煮液中铵的靛酚蓝法和纳氏比色法。5v重点介绍凯氏定氮法、染料结合法、双缩脲法三种方法。v测定氨基酸主要的方法是利用氨基酸自动分析仪、茚三酮法、染料结合法、乙醛酸法
3、、荧光法等。v重点介绍氨基酸自动分析仪法测定全氨基酸、染料结合法测定赖氨酸及乙醛酸法测定色氨酸。6u 粗蛋白质的测定凯氏定氮法这种方法是1883年丹麦人开道尔(JKjeldahl)发明，当时凯氏只使用H2SO4来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用H2SO4分解试样，而不能阐明H2SO4分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用H2SO4分解试样，需要较长时间，后来由Gunning进行改进，他是在消化时加入K2SO4使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的330上升到400，所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用。7v优点：具有应用范围广、灵敏度高、回收率好及不需昂贵仪
4、器等优点。缺点：操作较费时(除自动凯氏定氮法外)，单消化过程一般就需要23 h，如果遇到高脂肪、高蛋白样品消化需要5 h以上；在操作过程中会产生大量有害气体。 8v我们在检验农产品中pro时，往往只限于测定总氮量，然后乘以pro核算因数，得到蛋白质含量，实际上包括氨基酸、酰氨、核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等非蛋白质含氮化合物，故称为粗pro。v如果蛋白质用重金属盐等沉淀分离以后，进行全氮测定，由氮换算而成的蛋白质的含量，则称为“纯蛋白质”。9（一）方法原理氮素是蛋白质中的主要成分。同类植物蛋氮素是蛋白质中的主要成分。同类植物蛋白质的含氮量基本上是固定的。因此，白质的含氮量基本上是固定
5、的。因此，可将测得含氮值乘以换算因数，即得蛋可将测得含氮值乘以换算因数，即得蛋白质含量。白质含量。 10样品与硫酸和催化剂一同加热后消化，使蛋白质分解，其中的碳和氢分别被氧化成二氧化碳和水逸出，而有机氮转化成氨后与硫酸结合生成硫酸铵，然后在碱性条件下蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再用硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即得蛋白质含量。该过程的反应方程式表示如下：11v消化：2NH2(CH2)2COOH + 13H2SO4(NH4)2SO4 + 6CO2+ 12SO2 + 16H2Ov蒸馏：(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3+ Na2SO4 + 2H2Ov吸收：2NH3 +
6、 4H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2Ov滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO412v在消化过程中，为了加速蛋白质的分解，缩短消化时间，常加入硫酸钾、硫酸铜等物质。加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物分解，因为它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度。但其加入量不能太大，否则消化温度过高，又会引起已生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。13（二）操作步骤v 1、蛋白质的沉淀 v 2、蛋白质的消 煮 v 3、氮的测定 14样 品 （ 0.5m m）沸水取下放置30分钟1、蛋白质的沉淀沸 腾 5minCuSO4溶液 NaOH溶液 ？ 放置
7、半至1小时倾泻法过滤沉淀沸水洗涤烘干 60152、蛋白质的消煮沉淀浓H2SO4放置2小时或过夜110的CuSO4K2SO4小火加热加 大 火 力至无色透明冷却后煮30min电炉消煮液呈棕色163、氮的测定蒸馏法： 吸取定容后的澄清待测液（常量法可吸取25-50毫升，含氮约10-20毫克；半微量法吸取1-5毫升，含氮约0.5-1毫克），用常量法或半微量法测氮，同时做空白试验。 17(三)各种试剂的作用:v浓H2SO4：A ：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将H2SO4还原为SO2，本身则变为CO2B： 氧化C： pro与浓H2SO4生成NH3，CO2，SO2，H2OD： NH3与H2S
8、O4生成硫酸铵18vCuSO4的作用（催化剂）v起催化作用外，还可作消化终点和下一步蒸馏时碱性反应的指示剂。vCu2SO4为红色沉淀，当C完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为CuSO4的颜色。19v3、硒粉和过氧化氢、氧化汞都为催化剂，但考虑到效果、价格及其环境污染等，通常采用硫酸铜。v4. NaOH的作用碱性条件下蒸馏使氨游离。20v5、K2SO4的作用（提高沸点）沸点由330提高到400加速了反应过程，加速有机物的分解。21（四）适用范围v凯氏定氮法适用于各类农产品中的蛋白质测定，最低检出量为0.05mg氮，相当于0.3mg蛋白质，本法测出的结果为粗蛋白质含量
9、22（五）注意事项蛋白质沉淀剂通常采用碱性硫酸铜， 它有迅速得到澄清溶液的优点。牧草、块根块茎作物：碱性醋酸铅为沉淀剂。 谷物及油料作物：由于碱性醋酸铅在沉淀蛋白质时产生不易沉淀的浑浊物，因此不易正确决定沉淀完全的终点，故少采用。下一页23（五）注意事项v1、样品应均匀，若是固体样品应事先研细，液体样品要混合均匀。v2、样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，万一黏附可用少量水缓慢冲下，以免被检样消化不完全，使结果偏低。24v3、消化过程中应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。v4、消化时，如不容易呈透明溶液，可将凯氏烧瓶放冷后，加入30%过氧化氢催化
10、剂2-3ml，促使氧化。25v5、在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏烧瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。v6、如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这时会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过少，底物被消耗掉或样品中脂肪含量过高时，要添加硫酸量。26v7、混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色，如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲醛红乙醇溶液。v8、氨是否完全蒸馏出来，pH试纸检查馏出液是否为碱性。27v9、向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀。这时由于分解促进剂与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加
11、热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深蓝色的络合物。v10、所有的试剂溶液应用不含氮的蒸馏水配制。 28v11、消化剂变绿色后继续消化30分钟即可。但对于特别难以氨化的氮化合物样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁较多时，呈较深绿色。29v12、样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时必须先低温消化，并时时摇动；或者加入少量辛醇、液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。30v13、若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样15ml的比例增加硫酸用
12、量。v14、蒸馏时加入氢氧化钠溶液必须小心轻加，而且蒸馏装置不能漏气。v15、加碱要足量（反应室液体呈深蓝色或褐色）并且碱液不能污染冷凝管及接收瓶。31v16、硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。另外，冷凝管下端不能插入硼酸液面太深，一般约为0.5cm，这样万一发生倒吸现象时，硼酸液不致吸入反应室内。v17、蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸lmin后关掉热源，否则可能导致吸收液倒吸。32v18、一般样品中尚含其他含氮物质，测出的蛋白质为粗蛋白。若要测定样品的“纯蛋白质”，则需向样品中加入蛋白质沉淀剂如氢氧化铜、碱性醋酸铅、2
13、0-25单宁、10-12三氯乙酸溶液等，将蛋白质从水溶液中沉淀出来，再测定此沉淀的全氮量，乘以蛋白质的换算系数即可得“纯蛋白质”量。33v19、在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽，否则将发生倒吸。v20、称样量的大小取决于样品的含氮量。若含氮为1.05.0，称样量为0.30g，可根据含氮量的水平适当增减称样量。称样量不宜少于0.1g，如果样品含氮量高，可将消煮好的溶液定容，取一部分用于蒸馏、滴定。34v21、废液排除及洗涤。v22、氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为1517.6，按16计算乘以6.25即为蛋白质量。不同食物中蛋白质换算系数不同。3536v核对试验 将
14、已知量的NH4+-N标准溶液(如100mg/LNH4+-N标准溶液10ml，其中含N1mg)放入半微量定氮蒸馏装置中，按样品测定同样操作步骤进行蒸馏、滴定，用以检验蒸馏过程中的误差大小。v指示剂的加入量仍为2（v/v）37v硼酸的浓度可根据样品中氮的含量来调节2-5。v测定两种蛋白质的平行结果为15以下，相对误差不得大于3，1530时为2，30以上为1。v其他参见土壤全氮的测定，如催化剂仍用1.85g较合适。 38二、同类种子中蛋白质的测定(染料结合DBC法)(一)方法原理 蛋白质中的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)的NH2、咪唑基和胍基（赖氨酸的-NH3+、 组氨酸的咪唑基、 精氨酸的胍
15、基）以及蛋白质末端自由氨基在pH=23的酸性缓冲液体系中呈阳离子状态存在，可以和偶氮磺酸染料类物质如橘黄G、酸性橙12#等的阴离子结合，形成不溶于水的蛋白质染料络合物而沉淀下来。39通过测定一定量样品与一定量体积的已知浓度染料溶液反应前后溶液中染料浓度的变化，可计算出样品的染料结合量，即每克样品所结合的染料的毫克数。 染料结合量的大小反映出样品中碱性氨基酸的多少。40v赖氨酸（-NH2 ）v组氨酸（咪唑 基） v精氨酸（胍基 ）41v在小麦、大麦、水稻、大豆、花生等种子中蛋白质的含量与碱性氨基酸的含量之间有很好的相关性。因此，可以用染料结合量来评比同种作物种子大量原始材料之间蛋白质含量的高低。
16、42v如果要从染料结合量来计算样品的粗蛋白质的含量，则需用开氏法测定同类种子的一批样品的粗蛋白质的质量分数，同时也用染料结合法测定其染料结合量，然后求出粗蛋白质含量()对染料结合量的回归方程或绘出回归曲线。这样，测定未知样品的染料结合量，就可以从回归方程计算或查回归线得到粗蛋白质()含量。43v该法是间接测定种子中蛋白质的方法。v方法简单、快速，与开氏法的相关性较好，但准确性较差，适用于大批样品的筛选工作。美国谷物化学协会将该法列为分析小麦蛋白质含量的正式方法(AACC11-272)。44（二）注意事项v1该法对随意混合物的样品不适用。v2. 样品称样量按蛋白质含量的高低而定。水稻、小麦、大麦等可称取500mg，玉米称取700mg，大豆称取200mg，花生及鱼粉等可少一些。v3染料结合反应的条件，如染料的pH、样品的粒度、振荡反应时间和温度等影响到测定的结果，故应力求每次测定的反应条件一致，特别是测定样品与测定回归方程的
