网织红细胞检测进展及其临床应用

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1、网织红细胞检测进展及其临床 应用概述网织红细胞(reticulocyte，Ret)是介于晚幼红 细胞和成熟红细胞之间的过渡阶段细胞，略大于 成熟红细胞。网织红细胞是有核红细胞刚刚失去 核的阶段，仍属未完全成熟的红细胞，浆内尚残 留有嗜碱性RNA，经碱性染料（如天青B、煌焦 油蓝或新亚甲蓝）活体染色后，在包体内可见蓝 色点状或网状结构，故名网织红细胞。概述红细胞在骨髓中生成，至发育为成熟红细胞，经历 了不同阶段：干细胞、原始红细胞、早幼红细胞、中幼 红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞，最后发育为成熟红 细胞。随着细胞的成熟，RNA含量逐渐减低，至细胞完 全成熟后消失或接近消失，即红细胞中网线状结构越

2、多 ，表示细胞越幼稚。ICSH将Ret分为4型：型（丝球型 ）、型（花冠型或网型）、型（破网型）、型（ 颗粒型）。正常生理状态下，型只存在于骨髓，型 在外周血也很难见到，型仅有少量释放到外周血，因 此外周血网织红细胞计数时以型为主。概述Ret是红细胞成熟过程中的一个重要阶段， 是判断骨髓红系造血情况和疗效观察的重要指 标。其检测方法既有传统的显微镜目测法，又 有现代化的仪器计数法(如流式细胞仪、网织红 细胞计数仪及血细胞分析仪)。现对Ret的检测进 展，各检测方法的优缺点及其在临床上的应用 逐一讲述。网织红细胞检测进展1.手工法2.血细胞分析仪法3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪1.手工法

3、手工法分玻片法和试管法。由于玻片法容易使 混合血液中的水分蒸发，染色时间偏短，因此结果 偏低；试管法容易掌握，重复性较好，必要时还可 以从混合血液中再取标本重新涂片复查。试管法被 列为手工法Ret计数的参考方法。按卫生部全国 临床检验操作规程第2版，采用试管法用煌焦油 蓝染液对血液标本进行红细胞活体染色、制片，选 择细胞分布较均匀、厚薄适中的体尾交界处，每份 标本油镜下参照陈宝梁的建议 ，即Ret6 %，计数 红细胞1000个；3% 5 %计数红细胞2000个；1 % 2% 应计数红细胞4000个；小于1 %计数红细胞 10000个。1.手工法传统的显微镜计数方法操作较繁 琐、影响结果的因素较

4、多。近年来， 国内开始使用国际血液学标准化委员 会(ICSH)推荐的Miller窥盘进行计数， 规范了计算区域，减少了实验误差， 使结果准确性有所提高(卫生部临检中 心建议，CV控制在15 %之内)。Miller 窥盘法是将一种光学圆片状Miller窥盘 安放在显微镜目镜中，窥盘中有面积 比例为1：9的2个正方形计数方格，只 需计数19小方格内的红细胞即可准确 估量出整个大方格内的红细胞数量。卫生部临床检验中心控制Ret计数CV15%需镜检的RBC数目Ret(%) 计数Miller窥盘小方 格RBC 相当于缩视野法计数 RBC数目 1-244440003-52222000611110001.手

5、工法国内很多学者在此基础上设计 了几种改良的Ret计数窥盘。张时 民等设计了一种双环式结构的Ret 计数窥盘，该盘的特点是小圆环和 大圆环面积之比为1：10，小圆环为 计数红细胞数量，大圆环为计数 Ret数量。其圆形结构更加适合于 人们观察和计数显微镜下细胞数量 的习惯，而且此比例更加易于计算 红细胞和Ret的比值。1.手工法陈高远则在这两种窥盘的 基础上设计了改良式Miller窥 盘，采用双正方形结构，小方 格和大方格之比也达到1：10， 只是将红细胞计数区域位移至 中心部位，以方便红细胞数量 的计数。1.手工法刘志贤设计了一种新的Ret计数 窥盘即1804扇形Ret计数窥盘：圆形 直径为1

6、9 mm，圆心角 AOB=COD=EOF= GOH=180 。弧AB=CD=EF=GH=180。计算公 式为：Ret %=整个计数区域内的Ret 数(4个小扇面区域内的RBC总数 5)100 。这种新型Ret计数窥盘4 个扇形区域均匀分布在整个视野的4 个方向，4个扇形面积之和是整个圆 形面积的15，因此在理论上基本解 决了红细胞分布不均匀引起的问题， 降低了系统误差和随机误差 。手工法网织红细胞活体染色染料评价染料评价 新亚甲蓝WHO推荐使用，对RNA着色强，试剂稳定 ，Hb几乎不着色煌焦油蓝溶解度低，染料沉渣易附着红细胞表面， 影响辨认；易受变性珠蛋白小体、HbH包 涵体干扰 中性红染液浓

7、度低、背景清晰、网织颗粒与红细 胞对比鲜明；不受变性珠蛋白小体、HbH 包涵体干扰2.血细胞分析仪法1993年以来，可进行Ret计数的血细胞分析 仪相继问世，因其具有重复性好、准确度高、 省时等优点，正被越来越多的医院所采用。仪 器法Ret计数使用各种荧光染料和非荧光染料 对Ret进行染色，采用鞘流技术和射频技术等 不同原理进行检测。血细胞计数仪不仅可以计 数Ret，同时还能检测出网织红细胞绝对值 Ret#、网织红细胞平均体积(MRV)、网织红细 胞成熟指数(RMI)等许多参数，这些参数是Ret 分析、临床应用和研究的热门领域。2.血细胞分析仪法统计表明，仪器法测定Ret精密度 有明显提高：对

8、低Ret标本，CV值在 10%21 %之间；对正常范围的标本 ，C V值在3 %16 %之间；高值标本 ，C V值在2 %10 %之间。2.血细胞分析仪法虽然仪器法Ret计数有诸多优点，而且精密度明显 优于手工法，但也存在一些不足 ：第一，所有仪器分析 的基本原理都是检测Ret内RNA 的存在量来决定其百分 率和绝对值，当某些患者血液中有核细胞或淋巴细胞异 常增加时，可导致Ret计数结果的假性增加；第二，冷凝 集素存在、红细胞的聚集、某些病理因素或药物都能使 红细胞产生自身荧光；第三，自动化分析仪结果的准确 性除了依赖于仪器本身的良好性能外，还应有良好的质 控物随时检测仪器的状态。另外，仪器成

9、本高、价格贵 ，基层医疗单位投入较为困难。3.流式细胞仪法和专用网织红细胞分析仪流式细胞仪(flowcytometry，FCM)是一种多用途 的精密分析仪器，应用派若宁、吖啶橙、噻唑橙等这 些特殊的荧光染料与Ret中的RNA结合，当FCM 发出 的激光照射于细胞上时，根据细胞能否发射出特定颜 色的荧光，通过单参数定量测定RNA，从而精确测定 Ret占成熟红细胞的比率。还可根据激光照射后发射出 的荧光强度，或光吸收量大小、光散射量多少等参数 的比例关系对Ret成熟程度进行分群，将其划分为低荧 光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞 (MFR)、高荧光强度网织红细胞(HFR)。3.流式细

10、胞仪法和专用网织红细胞分析仪FCM 测定精密度明显高于手工法36倍， 可在数秒中检测20000个以上的红细胞，如Ret 在1.76.6 %，其平均CV值在4.3 %。不足之 处，流式细胞仪计数Ret受HOWELLJolly小 体、疟原虫和血小板等干扰。网织红细胞计数方法学评价检测方法评价普通显微镜法简便、成本低，可直观细胞形态；影响因素多 ，重复性差玻片法水分易蒸发，染色时间短，结果偏低试管法易掌握，重复性较好，易复查Miller窥盘计数法规范计算区域，减少了实验误差，ICSH推荐方 法仪器法检测细胞多，精密度高，与手工法相关性好， 易标准化。仪器贵；受H-J小体、有核红细胞、 血小板等干扰网

11、织红细胞检测的临床应用Ret计数及其各种参数(IRF、RMI、 MRV、RPI等)在贫血的诊治、骨髓移植 、肿瘤的放化疗和药物疗效检测等方面 具有重要参考价值。1网织红细胞计数的应用贫血的恢复是通过骨髓释放红细胞生成素(EPO) 完成的，Ret增加可被看成是骨髓造血功能对贫血的 正常反应。失血性贫血时患者Ret各项指标会显著增 高，失血510 d内Ret可达高峰，出血停止后2周可 恢复正常，临床上可应用此参数和特点来判别出血 是否停止；缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血时也可见 患者Ret轻度增加。Ret降低主要和造血功能减低有 关，典型病例为原发性再生障碍性贫血、溶血性再 生障碍性危象；此外还有急性

12、白血病、继发性再生 障碍性贫血、化疗和放疗引起的骨髓造血功能抑制 或减退等。2网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI代表网织红细胞的生成相当于正常 人的多少倍。不同生理、病理情况下，Ret 从骨髓释放人外周血所需时间不同，故Ret 计数值不能确切反映骨髓红细胞系统造血功 能，还应考虑Ret生存期限。通常Ret生存期 限约为2d，若未成熟网织红细胞提前释放 入血，Ret生存期限将延长，为了纠正网织 红细胞提前释放引起的偏差，用RPI来反映 Ret生成速率。 2网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI= RET% 被测HCT/ 正常人HCT 1/ RET 成熟天数。释放入外周血的网织红细 胞越趋

13、于幼稚，其成熟时间越长。由于网织红 细胞体积大于成熟红细胞，大量网织红细胞的 提前释放在某种程度上影响血细胞比容的测定 结果。经观察，网织红细胞成熟时间与Hct存 在下列关系 HCT0.39-0.450.34-0.380.24-0.330.15-0.23 0.15Ret成熟 时间(d)11.52.02.53.02网织红细胞生成指数(RPI)的应用RPI在估计红细胞生成有效性和贫血起 因的分类方法中起到重要作用。Kinetic等应 用RPI较为准确地表达出Ret的成熟状态，从 而对贫血的类型进行划分，如健康者平均 RPI为1，当RPI3时表示红细胞生成增加， 如溶血性贫血和治疗后的营养性贫血；而

14、 RPI2时为红细胞生成减少，如缺铁性贫血 ；对于EPO缺乏、无效造血等情况时，RPI 多在23之间，Kinetic法则还无法确定。3网织红细胞成熟度(IRF)的应用IRF为不成熟的Ret与总Ret的比值，健康者平均值为0.22，参 考范围0.10.38，IRF越大表示不成熟的Ret的数量越多。这种幼 稚Ret水平的改变一般比患者HGB、血小板、白细胞和临床症状 的变化出现更早。IRF和HFR的增高在很多白血病患者化疗中是 与粒细胞反应一致的指标和骨髓移植后恢复的第一信号 。IRF与 Ret#和RPI呈一弱的、显著的正相关：IRF增加(0.23)，一般伴 有Ret#增加，提示患者对于贫血有足够

15、的红系反应；若IRF0.23 ，且RPI2，则说明红系造血活性下降，则以慢性肾功能不全居 多；Ret#正常或略低，RPI2，但IRF0.23，见于急性感染、镰 状细胞性贫血危象、妊娠和MDS等状况。IRF是评价贫血红系增 生活性的一项新的有用的指标，IRF结合Ret#和RPI可以为进一 步阐明贫血分类提供有价值的信息。4网织红细胞成熟指数(RMI) 的应用该参数是计算参数，可由仪器自动计算， 也可将仪器测定的Ret分群参数经过人工计算 得到。计算公式为：RMI=(MFR+HFR) LFR100 %。文献报道RMI的参考范围，男性 ：17 % 37 %，女性：1 6 %35 %。据报道 ，急性白

16、血病化疗后Ret#正常而RMI较高， 化疗中则Ret#和RMI都低；出现溶血危象时 Ret#和RMI都高；ITP则Ret#正常而RMI较高 。5网织红细胞分群的应用LFR 和HFR可作为贫血鉴别诊断的初筛指标。研究表明，溶血性贫血(HA)患者由于骨髓造血功能活 跃，大量新生的Ret释放到外周血，导致Ret、LFR和HFR 明显增高；。肾性贫血时HFR上升，LFR下降而Ret变化 不大；缺铁性贫血患者铁剂治疗前，Ret无明显改变， HFR轻度增高，铁剂治疗一周后，Ret及HFR可呈中度增 高，因此两个参数可作为缺铁性贫血患者铁剂治疗后的疗 效观察指标；再生障碍性贫血(AA)患者外周血Ret中度减 低，而HFR中度增高，这种现象可能反映了AA患者造血 功能紊乱时的红细胞生成变化；在鉴别诊断MDS方面， MDS患者产生的大量生存期延长的“幼稚”的Ret是导致 HFR增加的原因。5网织红细胞分群的应用HFR和MFR+HFR可作为骨髓移植、化疗 的监测指标，尤其是MFR+H