细胞总RNA提取及逆转录

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1、分子生物学实验分子生物学实验1、 每组同学做一份实验；2、 遵守实验室规则，穿白衣；3、 同学们在听课时要作好记录; 4、 上课时间。欢迎大家参加分生实验课的学习！1. 实验成绩考核占总成绩15%。2. 每次实验报告5分含随堂测试，共三次，合15分。3. 缺实验课成绩者，本课程不予通过。【每名同学的3个实验报告放在一起，最后一次实验课交。学生交卷后签名。教师按学号排卷。】20132013年年 五年制五年制 实验课考试形式实验课考试形式1. 加样器2. 离心机 先介绍本轮实验中两种先介绍本轮实验中两种 常用仪器的使用方法常用仪器的使用方法3、 根据取样量，选择合适量程的加样器。顶部标记加样器的最

2、大量程，分别为：20 l: 0.5 20 l 100 l: 20 100 l 1000 l: 200 1000 l 一、加样器的使用及注意事项1、 用途 微量吸取液体2、 每组3支加样器Q：如果要吸取5l、50l、150l、 500l的 液体，应选择哪个加样器?练习：加样器读数为练习：加样器读数为 100100，实际体积各为多少，实际体积各为多少? ?4、如何调节？(1)首先观察目前的读数,假设为050:最大量程为20l的加样器 5l最大量程为100l的加样器 50l最大量程为1000l的加样器 500l(2) 顺时针调节- 读数变小 逆时针调节- 读数变大(3) 注意：调节前，加样器读数正处

3、于最大量程或最 小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量 程，将会损害加样器的精度。5、加样器使用步骤：1）选择选择 加样样器,观观察读读数,调节读调节读 数。安装吸头头要紧紧密(不要用手直接拿吸头头)，安装后旋转转固定一下 。2）在液面外液面外，先按到第一第一挡挡。3）将吸头头插入液面下的适当深度:过过深可能会腐蚀蚀加样样器, 过过浅可能会吸入空气。4）缓缓慢松开拇指,吸取液体。完全放开拇指后，停留半秒钟钟。急于离开液面，易吸入空气。5）抬起加样样器,估计计体积积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去6）贴贴容器内壁，加样样器推到第二挡第二挡将液体匀速打出。(吸头头内有液 体时时，不能将加样

4、样器平放或倒置，液体会倒流损损坏加样样器！)7) 观观察吸头头内液体是否完全打出，将吸头头弃于废废物盒内。第一挡为实际读数体积，第二挡为帮助彻底打出液体，避免吸头内液体残留。1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀 。1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。3、将样品标记好并配平 , 对称放入离心机（ 管的连接处朝外）。4、设定离心的转速和时 间。5、统一离心。Team Work二、离心机的使用及注意事项 实验一、 细胞总RNA的提取及逆 转录实验内容：实验内容：1、小鼠肝脏组织总RNA的提取 2、RNA的变性变性琼脂糖凝胶电泳 3、以总RNA为模板的逆转录反应一

5、、真核细胞的总一、真核细胞的总RNA RNA 1、mRNA: 1-5% 5鸟鸟嘌呤7位甲基化CH3修饰饰。 1）免受核酸酶破坏，2）起始、促进进蛋白质质合成。3poly(A)尾巴结结构 20-200个A. 翻译译所必需。起始密码码：AUG 终终止密码码：UAA,UAG,UGA。 2、tRNA: 10-15%3、rRNA: 80-85%大亚亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚亚基40S: 18S=1874nt第一步： 提取小鼠肝脏组织的RNA二、二、RNARNA提取的注意事项提取的注意事项 RNARNA酶酶：广泛存在：灰尘尘、人体唾液、实验实验 器材表

6、面。生物活性非常稳稳定：耐热热、耐酸、耐碱。1、 尽量避免外外源性RNase 污污染A. 操作环环境空气洁净洁净 。带带手套、口罩。B. 用新开封的化学试剂试剂 。（试剂应该专试剂应该专 用）C. 一次性塑料器材最好是新开封，(DEPC水处处理后）高压灭压灭 菌。D. 玻璃器材、水都应该经过应该经过 去RNase 处处理。对对玻璃器材还应该进还应该进 行高温烘烤。2、抑制内内源性RNase 活性： RNase 抑制剂剂。RNARNA分离的关键因素：避免分离的关键因素：避免RNARNA酶的污染。酶的污染。1) 发放口罩、帽子、手套，每个组来一个人领取。将1mL Trizol试剂移入Eppendo

7、rf管中。2) 实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不 宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。3) 将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL的Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2min以上。 使组织细胞充分裂解充分裂解。肉眼观察可见液体变成均 匀浑浊状。 4)室温孵育10 min。三、三、RNARNA提取的实验操作提取的实验操作 1、异硫氰酸胍法：GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同 时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，通过有机 溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。特点：需低温操作，但价格经济。2 2、TrizolTrizol 试剂试剂（商品化产品

8、）（商品化产品）特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总RNARNA，简单、快速、提取量大、纯度高。简单、快速、提取量大、纯度高。3、mRNA提取试剂盒真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT 纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。课间课间 介绍绍 RNA提取的几种方法RNase抑制剂剂介绍绍1、DEPCDEPC ( 二乙基焦炭酸盐盐)最常用的RNase抑制剂剂: 与蛋白质质中的组组氨酸结结合，使蛋白质质 变变性。有效浓浓度：0.05%-0.1%(DEPC水)，室温磁力搅搅拌20分钟钟。 用于浸泡各种器材。灭灭活条件：高压压。 在Tris溶液中半衰

9、期为为1.25min。试剂试剂 的配制:无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压压)储储存方法：不能用聚苯乙烯烯器皿。4 C ，或液氮中。2、肝素肝素： 使用浓浓度：0.110mg/ml效 果: 37 C 时时，可抑制95%的RNase 活力。如果与DEPC联联合应应用， 具有极强的抑制 效果。5)加入200 l氯仿氯仿，震荡混匀20-30s，室温放置5min（此期间液体开始分层分层，此时不要轻易搅动液体）。)10000 rpm，离心5min。RNA (清澈透明)DNAProtein7) 将清澈透明的上上层水相层水相 转移至另一离心管中。三、三、RNARNA提取的实验操作提取的实验操作 8

10、) 沉淀RNA：加入0.5ml异丙醇异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min。10000rpm，离心10min。弃上清。) 加1ml 75%75%乙醇乙醇洗涤管壁。(注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀)10) 7500rpm离心1min，弃上清。再离心几秒钟，将管壁液体（用加样器）完全移净。用TriZol试剂提取总RNA时，全程均在室温进行。当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。12)室温干燥35min。（干燥的时间由RNA沉淀大小决定）（干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状无色胶样透明状，沉淀要充分干燥但避免过分干燥，此步骤非常关键）注意事项：RNA:避免放在37 C

11、孵箱中过度干燥以防无 法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留 ，容易造成RT的失败，但过分干燥又是造成 RNA不溶解的主要原因 。判断RNA沉淀是否充分干燥但又不是过 分干燥是逆转录成功的关键环节。RNA pellet：透明胶样 干燥后应该无色透明13） RNA的溶解：用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 13.5l，加到RNA上，反复吹打溶解RNA沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。14) 吸出 4.5 l溶液放到冰上备用 (将用于电泳)。 15) 剩余 9 l溶液放到冰上备用 （将用于RTPCR）。v注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充 分，一定要用加样样器反复多次吹打方可 。但由于溶液体积

12、积非常小，要避免出现现 气泡影响RNA的溶解。避免气泡的方法： 用加样器的第一挡 每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯 为止。逆转录转录 酶：存在于逆转录转录 病毒体内。 常见见有哺乳动动物型37oC，禽类类 型42oC 。以mRNA为为模板的DNA聚 合酶，形成与RNA碱基相互补补 DNA链链，后者称为为互补补DNA cDNA。RNAaseH的活性：切掉 DNA和RNA杂杂合链链上的RNA 。第二步：逆转录反应AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n) 3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n) 3-TTTTTT(18)-537-

13、42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RT第一步：第一步： 打开RNA链之间的二级结构，使Oligo dT 特异性地结合到 PolyA 尾。总RNA 9 lOligo dT (0.05g/ml) 1 l (终浓度：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65水浴10min，然后立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。在水浴10分钟时，开始RNA电泳。按照下列方法进行RT反应：RNA的变变性（甲醛变醛变 性法）：打开RNA分子二级结级结 构，其分子量和电电泳距离相关。5甲醛变醛变 性缓缓冲液 2 l甲酰酰胺 10 l37%甲醛醛 2 lRNA样样品 4.5 l上

14、样缓冲液 3 l混匀后， 21.5 l 直接电电泳上样样（100伏，1030分钟钟）上样样前可先预电预电 泳5min。注意: 电泳槽的清洁！所有试剂、器材、溶液需要灭RNA酶处理。 琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果第三步：RNA 的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳第二步：第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：5RT-buffer 4 lRNasin (40U/ml) 1 ldNTPs (10mmol/L) 4 lAMV 1 l轻弹管底混合，置42水浴1h。将上述反应移至68水浴10min（灭活RTase）， 并冰浴，保存备用。混匀后，可用离心机甩一下基本过程同DNA电泳一样，但：1.

15、必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有 溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽 量减少RNA酶对样品的降解；2. 因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行变性电泳以打开 其空间结构，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 RNA电电泳RNA电电泳结结果 rRNA可以作为内部 Marker分子，通过观察rRNA 的两条带（28S28S和和18S18S）的比的比 例例，可以判断所提取mRNA是 否存在降解。RNA电泳并不能判断mRNA 是否提取成功，也不作为鉴 定RNA提取质量的常规方法， 因为在电泳过程中RNA可能发 生降解。分析本次实验结果：28S