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1、现代分析技术第十章第十章 高效液相色谱法及超临界流体色谱法10.1 概述10.2 高效液相色谱法的基本原理10.3 高效液相色谱法的类型 10.4 高效液相色谱仪10.5 超临界流体色谱法10.6 实验技术210.1 概述HPLC high velocity, high resolution and high sensitivityHigh-Performance Liquid Chromatography High-Pressure Liquid Chromatography High-Price Liquid Chromatography34510.2 HPLC的基本原理GC的基本理论、基
2、本概念适用于HPLC。液相色谱的van Deemter方程6涡流扩散项纵向扩散项传质阻抗项板高H越小，分离效率越高。可以从色谱柱、流动相、及流速等方面综合考虑，提高HPLC的柱效的措施采用颗粒小而均匀的填料，填充均匀；采用表面多孔的填料，减小填料的孔隙深度；流动相采用小分子溶剂，减小粘度( H2O、ACN、MeOH) ；适当提高柱温，增大Dm；采用一定的流动相流速u(一般1 mL/min)7柱外效应：柱前峰展宽柱后峰展宽柱前峰展宽进样及进样器到色谱柱连接管引起柱前后展宽检测器流通池和连接管引起10.3 HPLC的类型 I 液液分配色谱法Liquid Liquid Partition Chrom
3、atography, LLPC固定相与流动相均为液体(互不相溶)；基本原理：组分在固定相和流动相上的不同分配而实现分离；固定相：早期涂渍固定液，容易流失，现较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。8（1）寿命长，固定液不易流失，柱稳定性高；（2）传质快，表面均一，无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（4）选择性好，可键合不同基团改变其选择性；（5）耐受各种溶剂，有利于梯度洗脱；流动相类别流动相按极性分：极性(乙腈、甲醇、水)；弱极性(氯仿、乙酸乙酯)；非极性(己烷)；9正相色谱法反向色谱法采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增
4、加选择性，以改进分离或调整出峰时间。II 液固吸附色谱法 Liquid Solid Absorption Chromatography, LSAC 1 0固定相：固体吸附剂（硅胶）基本原理：根据组分在固定相上的吸附作用的不同进行分离；样品分子(X)被流动相带入柱内，与流动相分子(S)在吸附剂的表面 发生竞争性的吸附作用.吸附平衡常数 K 越大，保留值越大。LASC中，流动相：烷烃为底剂的二元或多元溶剂，己烷乙酸乙酯；己烷氯仿III 离子交换色谱法 Ion Exchange Chromatography, IECK 越大，离子交换能力越强，固定相对被分析离子的保留越强；分析对象：离子(各种无机阴
5、阳离子)：SO42+、NO3、Cl、Na、Mg等有机酸碱、氨基酸11固定相：离子交换树脂 (聚苯乙烯和二乙烯基的交联聚合物，硅胶键合离子交换剂) 流动相：含有反离子的水溶液 (柠檬酸根离子、CO3、F)基本原理：样品中离子与离子交换树脂的交换能力的不同进行分离；1213IV 离子对色谱法 Ion Pair Chromatography, IPC固定相：C18/C8上涂渍或在流动相中加入与溶质分子电荷相反 的离子对试剂流动相：有机溶剂 (甲醇/乙腈水)加入离子对试剂离子对试剂：烷基铵类：(C4H9)4N+OH- 、C16H33(CH3)3 N+OH- (分析X)烷基磺酸类 ：己烷磺酸钠C6H13
6、SO3Na (分析X )基本原理：根据形成的离子对化合物在两相间分配不同而分离 。14生成的离子对与固定相的亲和力越大，保留越强，出峰越后 。分析对象：有机酸、有机碱等Column： IonPac NS1、NG1 Eluent ： 2 mM TBAOH, 24%48% ACN in 10 min Flow rate： 1.0 mL/min Detection： Conductivity (suppressor type) Regenerator：10 mN H2SO41. Methanesulfonic acid 5.0 g/mL (ppm)2. 1-Propanesulfonic acid
7、8.63. 1-Butanesulfonic acid 8.74. 1-Hexanesulfonic acid 8.85. 1-Heptanesulfonic acid 8.96. 1-Octanesulfonic acid 8.97. 1-Decanesulfonic acid 9.10 Retention time (min)12168S0.0416234578.0反相离子对反相离子对色谱色谱分离分离有机酸有机酸V 离子色谱法 Ion Chromatography, IC固定相：离子交换树脂 流动相：电解质溶液（高电导）分离原理：同IEC，离子交换后的洗脱液进入抑制柱后进行电导检测特点：抑
8、制柱将样品离子转变成相应的酸、碱增加电导，将洗脱液变成低电导成分降低背景干扰。16分析对象：无机、有机阴阳离子、糖类、氨基酸等抑制器的作用废液Back Ground： Na2CO3 / NaHCO3 (700S)NaF,NaCl,NaNO3 Na2HPO4,Na2SO4Retention timeConductivityNaFNaClNaNO3Na2HPO4Na2SO4Back Ground： Na2CO3 / NaHCO3 (700S)Retention timeConductivityHFHClHNO3H3PO4H2SO4Retention timeBack Ground： H2CO3 (
9、15S)Conductivity17抑制器w 安装在电导电导池之前 w 提高待测测离子的电导电导率：NaNa+ +, ,ClCl- -H H+ +, ,ClCl- - 提高灵敏度提高灵敏度 w 降低背景电导电导 (淋洗液) :NaNa+ +, ,HCOHCO3 3- -H H2 2COCO3 3 减少噪音减少噪音Na+, OH- H2O18Y+Na+抑制器的工作原理 (阴离子)X-: 样品中的阴离子 Y+: 样品中的阳离子H2OH2OOH-Na+Y+H2O Na+ Y+ X- Na+ CO32- (样品, 淋洗液)H+ H+ + CO32- H+ + X- 至检测器H2CO3H+X-H H+
10、+ O+ O2 2H2OH2 + OH-H2ONa+OH- , H2H2O , O2废液废液电电极 （）电电极 （）纯水或来自检 测器的流体 H+H+H+H+阳离子交换膜阳离子交换膜19H2OH2OH H+ + O+ O2 2H2OH2 + OH-H2O废液 / 气体废液H2O SO42- Y+ X- H+ MSA- (样样品e, 淋洗液）OH- OH-MSA-SO42-X-OH-MSA-SO42-X-H+ MSA- , O2H2O, H2H+ + OH-Y+ + OH- H+抑制器的工作原理 (阳离子)至检测器H2OY+OH-X-: 样品中的阴离子 Y+: 样品中的阳离子电电极 （）电电极
11、（）阴离子交换膜阴离子交换膜纯水或来自检测 器的液体 2020VI 空间排阻色谱法 Size Exclusion Chromatography, SEC22固定相：多孔性凝胶 流动相：水溶液或有机溶液分离原理：分离组分的分子尺寸 凝胶的孔径大小(葡聚糖凝胶，琼脂糖凝胶)动画特点：体积大的分子完全被排阻洗脱下来体积小的分子最后的被洗脱下来分析对象： 高聚物，生物大分子（蛋白、核酸）VII 亲和色谱法 Affinity Chromatography, AC固定相：固定相表面键合特异性配基流动相：类似LLPC（乙腈/甲醇、水等）分离原理：根据固定相对溶质的特异性吸附而分离分离过程：一般流动相携带试样
12、 亲和物与配基结合强洗脱能力的流动相 洗脱亲和物（大分子）23分离对象： 酶与基质（或抑制剂） 抗原与抗体 激素与受体 外源凝集素与核酸的碱基对10.4 高效液相色谱仪24仪器特点：高压、高效、高速分离对象：生物大分子、天然产物、高分子化合物、大多数高沸点有机化合物 工作过程：高压输液系统核心部件：高压泵压力范围：30 50 KPa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（7不够灵敏。33原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表明发生氧化还原反应，两电极间有电流通过，电流大小与待测物质浓度成正比。要点： 具有电活性物质示差折光检测器 differential refractive index d
13、etector原理：样品组分的折射率与流动相折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。要点：灵敏度低，不能用于梯度洗脱34蒸发光散射检测器 evaporative light-scattering detector, ELSD 35流出液雾化器雾化加热漂移管加热溶剂蒸发激光束照在溶质颗粒产生光散射散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关。要点：通用型质量检测器，可用于梯度洗脱分析对象：适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测10.5 超临界流体色谱 supercritical fluid chromatography, SFC36定义： 以超临
14、界流体为流动相的色谱分析法，具有GC和HPLC的优点，适于分析GC不能分析的高沸点、低挥发性的试样。超临界流体： 在高于临界压力与临界温度时，物质的一种状态。性质介于液体和气体之间。超临界流体既不是气体，也不是液体，而是一种介于二者之间的一种对分离很有利的流体。超临界流体的特性371）性质介于液体和气体之间；气体的低黏度，传质阻力小，可以快速高效的分离；液体的高密度，适于低温下分离热不稳定、分子量大的物质；SFC的扩散系数、粘度和溶解力都是密度的函数，可通过改变SFC的密度调节组分分离， 超临界流体的密度与压力有关。传质阻力小适于低温SFC的固定相和流动相38SFC色谱柱：填充柱 ：颗粒dp:
15、 310 m, Lcol: 25 cm,固定液膜厚： 几mm 交联毛细管柱：颗粒 df: 0.05 1 m , Lcol: 10 20 cm,固定液膜厚0.05 1 m SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）；键合到毛细管壁上的高聚物要点：CO2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收； 缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；SFC的流动相：超临界流体色谱仪器39与HPLC差别：1.HPLC只在柱入口加压，而SFC整个都处于高压下，使流动相处于高密度状态； 2.SFC必须装有毛细管限流器，以实现限流器两端相的转变高压泵 无脉冲的注射泵，通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量； 检测器 可采用HPLC的检测器(UV, FL)，也可采用GC的FID检测器.SFC中的压力控制40压力效应：在SFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。CO2流动相，当压力改变： 7.0 9.0106 Pa，则：C16H34的保留时间：
