病毒的发现特点和定义

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1、第七章病 毒第一节 概述n病毒的发现 n病毒的特点和定义 病毒的发现18代埃及王朝时代（1500年BC），浮雕刻有一条萎缩腿的祭司脊髓灰质炎。古希腊哲学家亚里斯多德早在公元前四世纪描述狂犬病症状。公元前23世纪，我国和印度都记载过天花。17世纪西欧的郁金香热花叶病毒使花瓣呈美丽的杂色。 病毒的发现此后，许多学者陆续发现了各种植物病毒、动物病毒和细菌病毒（噬菌体）。 病毒的发现人类初步认识病毒的存在，是在19世纪末期。1886年，德国的A.Mayer在荷兰发现烟草上出现深浅相间的绿色区域烟草花叶病毒。随后证实其具有传染性。1898年，荷兰学者M.W.Beijerinck独立进行了烟草花叶病病原体

2、的研究，首次提出其病原是一种“传染性的活性液体”或称“病毒”，从此病毒学的历史被揭开。 病毒的发现1935年美国的Stanley首次提纯并结晶了烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)TMV，认识有了大突破。接着，Bawden等进一步揭示了TMV的化学本质并不是纯蛋白，而是核蛋白。1940年德国的Kausche等首次在电镜下观察到TMV的杆状外形。 一、病毒的特点和定义 n病毒的特点n病毒的定义病毒的特点v形体极其微小，电镜下才能观察。v没有细胞构造。v其主要成分是核酸和蛋白质。v每一种病毒只含有一种核酸(DNA或RNA)。v既无产能酶系，也无蛋白质合成系统。v在宿主细胞协助下

3、，通过核酸的复制和核酸蛋白质装配 的形式进行增殖。v在宿主的细胞内营专性寄生。v在离体的条件下，能以无生命的化学大分子状态存在， 并可形成结晶。v对一般抗生素不敏感，但对干扰素敏感。病毒的定义n病毒是一种生物实体，其基因组是能利用细胞的合成系统在活细胞内复制，并合成能将病毒基因组转移到其他细胞中去的特殊颗粒的核酸分子（DNA或RNA）。 第二节 病毒学研究的基本方法 n病毒的分离与纯化 n病毒的测定 一、病毒的分离与纯化n标本的采集与处理n标本接种与感染表现 标本的采集与处理n足够量的活病毒n采集标本的种类n确定最适采集时间n标本处理的方法：加抗菌素除菌等方法。n标本处理后应立即接种，数小时内

4、可置50%中性甘油内4保存，较长时间冻存标本最好置-20以下或干冰保存。标本接种与感染表现n标本接种于何种实验宿主以及选择何种接种途径主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性，同时应考虑操作简单、易于培养、所产生的感染结果容易判定等要求。噬菌斑n将噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即为噬菌斑。噬菌斑(plaque)下层培养基双层培养基敏感菌+上层培养基噬菌体稀释液培养噬菌斑噬菌斑敏感菌菌苔噬菌斑(plaque)概念：噬菌斑是指在宿主 细菌的菌苔上，噬菌体使 菌体裂解而形成的空斑。Localized areas of cellular dest

5、ruction and lysis caused by virus infection are called plaques 应用：1、噬菌体定量计数2、噬菌体的鉴定空斑和蚀斑在动物细胞培养物上的与噬菌斑类似的空斑，称为蚀斑。因为受肿瘤病毒感染。蚀斑（空斑）n若动物病毒标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区，即蚀斑（空斑）。枯斑n植物病毒接种敏感植物叶片可产生坏死斑，称为枯斑。枯斑包涵体（inclusion body）v在病毒感染寄主细胞时，对被感染细胞进行染色，则可观察到细胞内有明显区别的大小不等的颗粒状结构体，这些结构体总称为包涵体。包涵体

6、v包涵体可分为两类。v一类是在细胞内增殖的病毒颗粒及集落，如腹股沟淋巴肉芽病毒和天花病毒的包涵体。v另一类是由于病毒感染后，在细胞产生的一种反应生成物，例如由狂犬病病毒而引起狗脑神经细胞中的包涵体。包涵体v包涵体有的在细胞质中，腹股沟淋巴肉芽瘤、天花、狂犬病等。v有的在细胞核内，特称为核包涵体。包涵体是病毒的聚集体; 是病毒的合成部位; 是病毒蛋白和病毒感染有关的蛋白质病毒纯化 n病毒纯化的标准n病毒纯化的方法 病毒纯化的标准n病毒纯化有二个标准：n由于病毒是有感染性的生物体，所以纯化的病毒制备物应保持其感染性。n由于病毒具有化学大分子的属性，病毒毒粒具有均一的理化性质，所以纯化的病毒制备物的

7、毒粒大小、形态、密度、化学组成及抗原性质应具有均一性表现。病毒纯化的方法n根据病毒的基本理化性质建立纯化的方法：n毒粒的主要化学组成是蛋白质，鉴于病毒的高蛋白含量，故可利用蛋白质提纯方法来纯化病毒，如盐析、等电点沉淀、离子交换等。n毒粒是由许多大分子组成，离心时它们比细胞蛋白沉降更快，而且许多病毒都有较高的浮密度，所以超速离心技术广泛地用于病毒纯化。一般可在10000100000g的离心场中12h沉降。病毒纯化的方法病毒的测定 n病毒的物理颗粒计数（电镜下直接计数）n病毒的感染性测定病毒的感染性测定n病毒的感染单位：能够引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量(IU)。n病毒的效价：待测

8、样品中所含病毒的数量，通常以单位体积(ml)病毒悬液的感染单位数目来表示(IU/ml)。双层平板法琼脂平板菌液+噬菌体试样+琼脂培养基培养10天 计数噬菌斑噬菌斑数=试样中噬菌体数第三节 毒粒的性质 n毒粒的形态结构 n毒粒的化学组成 一、毒粒的形态结构n病毒的大小和形状n毒粒的壳状结构病毒的大小和形状n大小：病毒的大小常用纳米（nm、 109）来度量，病毒大小从10300nm之间，通常大小在100nm左右。n绝大多数病毒是能通过细菌滤器。n须用电镜才能观察到其具体形态和大小。n球状球状病毒（或多面体病毒）。动物病毒多为球状。n杆状杆状病毒（包括棒状或线状）。植物病毒多呈杆状。n蝌蚪状蝌蚪状病

9、毒。细菌病毒也即噬菌体多呈蝌蚪状。病毒的大小和形状Fig. 1B: Sizes and Shapes of Viruses (Animal DNA Viruses) Tobacco mosaic virus (TMV) 形状病 毒 大 小牛痘苗病毒传染性浓泡皮炎病毒 腮腺炎病毒T偶数病毒疱疹病毒大蚊病毒流感病毒烟草花叶病毒腺病毒多瘤病毒脊髓灰质炎病毒 1微米典型病毒粒子的构造衣壳(capsid) 核心(genome)衣壳粒(capsomere)衣壳 核酸包膜（envelope）糖蛋白核衣壳(nucleocapsid)毒粒的壳状结构病毒粒子的基本结构capsidcoreenvelopespike

10、nucleocapsid病毒粒子(virion)成熟的（结构完整）、具有侵 染力的单个病毒，又称病毒颗粒(virus particle)。Capsomere or capsomer三类典型形态的病毒n螺旋对称的代表-烟草花叶病毒(TMV)n二十面体对称的代表-腺病毒n复合对称的代表-T偶数噬菌体病毒的对称性三类典型形态的病毒： 廿面体对称的结构(球状) 螺旋对称的结构(杆状) 复合对称的结构(蝌蚪状)大肠杆菌的T偶数噬菌体是由椭圆形的二十面体头部和螺旋对称的尾部组合而成，是 病毒中复合对称的代表。病毒粒子的对称体系螺旋对称二十面体对称复合对称(A) Filamentous (B) Comple

11、x (C) Eicosahedral (D) EnvelopedRNA or DNAProtein Coat (Capsomers)Lipid envelope螺旋对称的病毒粒子Tobacco Mosaic Virus二十面体对称病毒粒子Adenovirus二十面体对称刺突tail pinsPhaga, bacterioohaga95nm95nmheadnecktail（24环）尾丝(tail fibers)65nm有囊膜的病毒粒子Fig. 4: Virus Obtaining Its Envelope from Host Cell Membrane by BuddingTransmissio

12、n Electron Micrograph of HIV-1 Budding from a Host Cell 二、毒粒的化学组成n病毒的核酸n病毒的蛋白质n其它化学成分（脂质、糖类等）一种病毒只含有一种核酸（DNA或RNA）。植物病毒绝大多数含DNA；少数含RNA；动物病毒一部分含DNA，一部分含RNA；细菌病毒普遍含DNA，含RNA的极少。病毒的核酸类型极为多样化： 病毒的DNA与RNA均有单链和双链：dsDNAssDNAdsRNAssRNA 病毒的核酸病毒DNA分子有线状和环状之分。病毒核酸有正链（）和负链（）的区分：规定：将碱基序列与mRNA一致的核酸单链定位正链，将碱基序列与mRNA

13、互补的核酸单链定位负链。因此，就病毒核酸链的单与双以及正和负有以下6 种类型：()DNA大部分DNA病毒()RNA动物呼肠孤病毒（）DNA 大肠杆菌X174噬菌体（）RNA所有单链RNA病毒大部分植物病毒（）DNA腺病毒（）RNA 流感病毒 病毒的核酸DNA，RAN之分单、双链（single strand,ss/double strand,ds）之分环状，线状之分(闭合,开放) 正负链之分病毒的蛋白质构成病毒外壳,保护病毒核酸免受核酸酶及其他理 化因子的破坏病毒蛋白还构成了病毒组成的酶.决定病毒感染的特异性,与易感细胞表面存在的受 体具特异亲合力,促使病毒粒子的吸附决定病毒的抗原性,并能刺激机

14、体产生相应的抗体其它化学成分脂类糖类原核生物病毒-噬菌体植物病毒 人类和脊椎动物病毒 昆虫病毒第四节 病毒的复制 一、病毒的复制周期 n一步生长曲线n以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细 胞，待病毒吸附后，或高倍稀释病毒-细胞培养物，或以抗病毒抗血清处理病毒-细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线。 一步生长曲线n从一步生长曲线中，可以获得病毒增殖的两个特征性数据：潜伏期和裂解量。 潜伏期和裂解量n潜伏期：是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间。n裂解

15、量：是每个受染细胞所产生的子代病毒的平均数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期效价之比。二、病毒的增殖过程 n病毒无生长过程，也不以二分裂方式繁殖，只由病毒核酸指令宿主细胞复制大量病毒核酸，继而合成大量病毒蛋白质，最后装配成大量子病毒，并自宿主细胞中释放出来。病毒的增殖过程n病毒的种类繁多，增殖时不同的病毒在细节上有所不同，现以研究最清楚的噬菌体为例作重点说明，噬菌体的增殖一般可以分为五个阶段：吸附 、侵入 、增殖 、装配和释放 。n原核生物病毒-噬菌体The lytic life cycle consists of the following steps: AdsorptionPenetrati

16、onReplication Maturation Release。 The Lytic Life Cycle of Lytic Bacteriophages由于绝大多数噬菌体为蝌蚪形，现以E.coli T4为例，介绍蝌蚪形噬菌体的结构：大肠杆菌T4噬菌体构造偶数噬菌体的形态构造噬菌体(bacteriophage,phage)吸附n指病毒以其特殊结构与宿主细胞表面的特异受体发生特异性结合的步骤。n两者发生偶然碰撞后，尾丝的尖端与宿主细胞表面的特异受体接触（尾丝的氨基酸与受体上的羧基形成化学键），就可触发颈须把卷紧的尾丝散开，附着在受体上，从而使刺突、尾板固着于细胞表面。吸附(adsorption)吸附的机理：尾丝尖端与受体发生共价结合。吸附(adsorption)