《高表达hmsd的前列腺癌pc3细胞对凋亡的影响及机制的研究(丁酸钠)1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高表达hmsd的前列腺癌pc3细胞对凋亡的影响及机制的研究(丁酸钠)1（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、人质膜型唾液酸酶对丁酸钠诱导细胞凋亡的影响及机制研究禹彬1.2 , 许莉1 , 孙连坤1, 李晓洁1 , 李扬1 * , 赵雪俭1（1. 吉林大学基础医学院病理生理教研室，吉林 长春 130021；2. 内蒙古民族大学附属医院, 内蒙古 通辽 028000）【摘要】 目的目的：研究人质膜型唾液酸酶(hmSD)对丁酸钠(NaBT)诱导人雄激素非依赖型前列腺癌细胞(PC3 细胞)凋亡的影响及其可能机制。方法：方法：以稳定转染 hmSD 的前列腺癌细胞(PC3-hmSD 细胞)为靶细胞，通过 MTT，流式细胞术，吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色等方法观察 hmSD 与凋亡的关系，应用细胞内ROS
2、测定，Western Blotting 等方法初步探讨 hmSD 的作用机制。结果：结果：1.NaBT 作用下 PC3-hmSD 细胞的生存率高于 PC3 细胞，PC3-hmSD 细胞的凋亡率低于 PC3 细胞；2.NaBT 诱导细胞内活性氧产生，PC3-hmSD 细胞与 PC3细胞比较无明显差异；3. NaBT 作用下，与 PC3 细胞比较，PC3-hmSD 细胞BclXL、P65 的蛋白表达增强，而 Caspase9 的蛋白表达减弱。结论：结论：1.hmSD具有抵抗 NaBT 诱导细胞凋亡的作用；2.hmSD 对 NaBT 诱导活性氧产生无抑制作用；3. hmSD 抗凋亡作用可能与 Bcl
3、-XL、P65 表达上调，Caspase9 表达下调有关。【关键词】人质膜型唾液酸酶，前列腺癌细胞，丁酸钠，凋亡 基金项目 吉林省科技厅资助项目（20010709）；教育部留学基金资助项目（2003）作者简介 禹彬（1974），女，黑龙江萝北县人，主治医师，医学硕士，主要从事肿瘤病理生理学的研究。*通讯作者（Tel:0431-85619485；Email:）Study of apoptosis and its mechanisms of hmSDoverexpressed PC3 cells induced by NaBT YU Bin1.2 , XU Li1 , SUN Lian-kun1
4、, LI Xiao-jie1 , LiYang1* , ZHAO Xue-jian1 (1. Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Science, Jilin University, Changchun 130021, China; 2. Affiliated Hospital of Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao 028000, China)Abstract: Objective To study of apoptosis and it
5、s mechanisms of hmSD overexpressed PC3 cells induced by NaBT. Methods The relation of hmSD and apoptosis was detected by MTT assay, AO/EB-staining and DNA ladder. The antiapoptotic mechanisms of hmSD was research by examining intracellular ROS and Western-blotting methods. Result 1. The survival rat
6、e of PC3-hmSD cells is higher than that of PC3 cells treated with NaBT, and the apoptosis rate of PC3-hmSD cells is lower. 2. It was found that no difference of fluorescence intensity between both cell line treated with NaBT. 3. The result of Western blotting showed that the expression of bcl-xl dec
7、reased in NaBT treated PC3 cells, but it increased in PC3-hmSD cells. Compared with respective control group, the expression of P65 and caspase9 increased in NaBT treated cells, but the increased P65 and decreased caspase9 expression was found in hmSD overexpressed cells. Conclusion 1. NaBT can indu
8、ce the apoptosis of PC3 cells, and hmSD can reverse it. 2. The pathway of hmSD against apoptosis may be no relation with the suppressed ROS synthesis. 3. The antiapoptotic mechanisms of hmSD may be involved in the downregulation of caspase9 and the upregulation of P65 and Bcl-xl expression.Key word:
9、 hmSD; PC3 cell; NaBT; apoptosis人质膜型唾液酸酶(human membrane associated sialidase/hmSD/Neu3)主要存在于细胞膜，是膜内在蛋白，具有严格底物特异性，在细胞表面调节上发挥重要作用1。许多研究表明 hmSD 与凋亡的发生密切相关。我们的前期工作证明hmSD 可抵抗丁酸钠(NaBT)诱导的前列腺癌细胞凋亡 。提示 hmSD 有可能成为新的前列腺癌的肿瘤标志物2。但二者之间的关系究竟如何，通过何种途径发挥其作用，hmSD 如何影响前列腺癌细胞凋亡，尚不清楚。本实验以稳定转染 hmSD 的人雄激素非依赖性前列腺癌 PC3 细胞
10、(PC3hmSD)为研究对象，在观察 NaBT 诱导细胞凋亡基础上，初步探讨其可能的机制，为前列腺癌的诊断治疗奠定实验基础。1 材料与方法材料与方法1.1 细胞株及试剂 将本实验室保存的前列腺癌细胞株 PC3，稳定转染 hmSD质粒的 PC3 细胞株(以下简写为 PC3-hmSD 细胞)，培养于含 10%小牛血清IMDM 培养液中，置于 37，5%CO2恒温培养箱中培养，第二天换液，2 到 3天传代。其中 PC3-hmSD 细胞培养液中加入 200gG418/ml，在给予 NaBT 处理前停用 G418。NaBT(以无菌去离子水配制成 0.2M 的贮存液，高压灭菌，4保存，使用时用培养液稀释成
11、所需浓度)。1.2 MTT 法检测 NaBT 对 PC3-hmSD 细胞和 PC3 细胞增殖的影响 分别取对数生长期 PC3-hmSD 细胞及 PC3 细胞，0.25胰酶消化后，调整细胞浓度为1105/ml，接种于无菌 96 孔培养板，24h 后细胞贴壁生长，分组加药。两种细胞分别分四组对照组，NaBT 2.5mM 组，NaBT 5mM 组,NaBT 10mM 1 2 3 4组。每组设三个培养时间(24h，48h，72h)，每个培养时间设四复孔。药物作用结束前 4h 每孔加 MTT(5mg/ml)20l，孵育 4h 弃培养液，每孔加DMSO100l，摇床震荡 10min，转移至酶标仪检测各孔的
12、吸光度值(OD570)。 1.3 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色检测凋亡细胞 取生长状态良好的PC3-hmSD 细胞及 PC3 细胞，调整浓度为 5105/ml，接种于 6 孔培养板，每孔1ml,孵育 24h,分为对照组和用药组(根据 MTT 结果选择 NaBT 5mM),作用 4h后，吸出培养液，PBS 洗三次，每孔加 PBS1ml 及配制好的 AO/EB 30l(其中AO、EB 各为 100g/ml)，避光孵育 10min，激光共聚焦显微镜观察照相记录（488nm，523nm 双波长激发）。1.4 DCFH-DA激光共聚焦法检测细胞内ROS水平 取对数生长期PC3-hmSD细胞和
13、PC3细胞接种于24孔培养板(4105/孔/ml)，37恒温培养24h后，分别加入NaBT 5mM作用细胞4h，PBS洗两次，每次5min，加入含DCFH-DA(10M)的PBS100l，37避光孵育30min，弃PBS，PBS 洗涤细胞两次(5min/次)，以充分去除未进入细胞的DCFH-DA。激光共聚焦显微镜观察药物作用后的荧光强度(激发波长488nm，发射波长525nm)，荧光强度代表细胞内活性氧的产生情况。1.5 Western Blotting检测Bcl-XL、P65、Caspase9的蛋白表达 PC3-hmSD细胞和PC3细胞，分别经NaBT 5mM作用8h，提取每组细胞的总蛋白，
14、采用Bio-Rad法测定蛋白含量。取总蛋白80g作SDS-PAGE电泳分离蛋白样本。用电转仪将蛋白样本转移至PVDF膜上，电流等于胶面积0.55。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭1h，PBST洗三次，分别加入BclXL抗体、P65抗体、Caspase9抗体 (1：500稀释)，4过夜。次晨，PBST洗三遍，10min/遍，加入Western Blotting 过氧化物酶标记的IgG(1：2000稀释)，脱色摇床摇1h，PBST洗三遍，5min/遍。DAB显色，拍照。1.6 统计学方法 各组数据采用 meanSD 表示，统计学处理采用 SPSS11.5 软件分析，各实验组间均值比较采用 ANOVA
15、检验。2 2 结结 果果2.1 NaBT对PC3-hmSD细胞和PC3细胞生长的影响 MTT比色法结果显示，随着NaBT作用时间的延长和剂量的增加，细胞存活率逐渐降低。并且相同剂量、相同时间，PC3-hmSD细胞的存活率高于PC3细胞（如图1所示）。#00.20.40.60.811.2CON2.5mM5mM10mM24hPC3 PC3-hmSD#*#*#00.20.40.60.811.2CON2.5mM5mM10mM48hPC3PC3-hmSD#*A B# *# * #00.20.40.60.811.2CON2.5mM5mM10mM72hPC3PC3-hmSD# *图1. NaBT处理后PC3
16、-hmSD细胞和PC3细胞生存率（24h,48h,72h）Fig1. The survival rate of PC3-hmSD and PC3 cells treated with NaBT * P0.05，* P0.01 compared with Control; n=4# P0.05，# P0.01 compared with PC3 cell; n=42.2 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色检测细胞凋亡 激光共聚焦显微镜观察，对照组细胞为梭形或多角形，细胞膜光滑无皱缩或发泡，细胞核染色质为均匀的绿色，形态规则。NaBT 5mM组作用4h后，细胞体积明显缩小，细胞核出现典型的凋亡形态改变，早期凋亡细胞：核染色质着绿色，低倍镜下呈荧光亢进的固缩状或圆珠状小体，高倍镜下呈不规则块状荧光（新绿色斑点）。晚期凋亡细胞：核染色质为
