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1、分光光度法分光光度法(一)基本原理 分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性吸收选择性吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一项技术。 Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的浓液成正比，与光束通过溶液的距离(即光程)成正比，用数学表达式表示为：A=KLCA=KLC C：物质的浓度，L：光程（cm），K为吸光系数或消光系数。（二）待测溶液的浓度计算（二）待测溶液的浓度计算1 1、利用标准管法计算待测溶液的浓度：、利用标准管法计算待测溶液的浓度：2 2、利用标准曲线进行换算：、利用标准曲线进行换算：3 3、利用吸光系数（消光系数）求出待测溶、利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度
2、。液的浓度。根据Lambert-beer定律：标准管：As=KLCs (下标S：标准液)待测管：Ax=KLCx (下标X：待测液)L相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则K相同，则： As/Ax=Cs/Cx即Cx=Ax/AsCs在实际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等(以X代表测定管含量，S代表标准管含量)则：X=Ax/X=Ax/AsSAsS计算待测溶液浓度时，可根据测定时实际吸取实际吸取的标准液的体积标准液的体积(Vs)(Vs)和待测样品的体积待测样品的体积( (VxVx) )，将上式演变为：待测溶液浓度：CxCx=Ax/=Ax/AsCsVs/VxAsCsVs/Vx利用标准管法
3、计算待测溶液的浓度利用标准管法计算待测溶液的浓度利用标准曲线进行换算利用标准曲线进行换算1 1标准曲线的作用标准曲线的作用(1) 又叫做校正曲线或工作曲线校正曲线或工作曲线。从浓度一光密度直线的直线特性，判断所采用方法的呈色反应是否符合呈色反应是否符合lambertlambertBeerBeer定律定律。(2)作多次平行测定多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等误差的大小，确定该测定方法的可靠性测定方法的可靠性。(3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度灵敏度。(4)大批样品分析时，省略多次计算省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲线而求得被测物质的浓度。标准曲线
4、的绘制标准曲线的绘制2 2标准曲线的作法标准曲线的作法(1) 标准液浓度的选择：标准液浓度选择一般应能包括待测样品的可能变异最低与最高值，一般选择选择5 5种浓度种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加成倍增加或等级增加。(2) 标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以减少仪器不稳定而产生的误差。(3) 标准曲线图的绘制：一般常用光密度一浓度标准曲光密度一浓度标准曲线线。【操作 】试剂试剂标标准管测测定管空白管1 2 3 4 5 6 7蛋白质标质标 准液 (ml)0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待测测血清样样本 (ml)1.00.9%NaCl(ml) 0.8 0.
5、6 0.4 0.2 1.0双缩脲试剂缩脲试剂 (ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.03、标准曲线图的绘制用普通方格纸作图。图纸长宽=11或长宽=32，以横轴为浓度，纵轴为光密度。绘制标准曲线时，将各座标点和原点连成一条线。若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点通过更多点，使不在直线上的点尽量均匀地均匀地分布在直线的两边分布在直线的两边。座标纸上注明：测定物及测定方法的名称，仪器型号、波长及绘制的日期、室温。标准曲线标准曲线根据Lambert-Beer定律， A A与与C C成正比成正比配制一系列标准液C1、C2、C3，在max下，测相应的A1、A2、A
6、3。实验项目实验项目, ,仪器型号仪器型号, , 波长波长, ,日期日期, ,室温室温. .mg/mlmg/ml利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度 根据Lambert-Beer氏定律：A=KLC 若C为1%（g/ml），L为1cm，此时的K值称为百分吸光系数用E1%1cm表示.即：C=A/E1%1cm 若C C为为1mol/L1mol/L，L L为为1cm1cm，其K值称为摩尔吸光系数摩尔吸光系数，用表示即；C=A/( (三三) )波长的选择波长的选择最大吸收峰的波长最大吸收峰的波长( (maxmax) ) 根据三个原则：1.被测溶液有适当的光
7、密度，适当的光密度为0.1- 0.7，以0.2- 0.6最理想。2.应使干扰影响降低至最低限度。3.应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。蛋白质定量分析技术蛋白质定量分析技术 双缩脲法双缩脲法 紫外分光光度法紫外分光光度法 BCABCA（二喹啉甲酸）法（二喹啉甲酸）法 LowryLowry法法(Lowry(Lowry改良法改良法) ) 考马斯考马斯( (ComessieComessie) )亮兰结合法亮兰结合法 凯氏定氮法凯氏定氮法双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量 双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多肽
8、键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。 操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小； 灵敏度较差，特异性不高。-CONH2、 -CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。【原理原理】【操作 】试剂试剂标标准管测测定管空白管1 2 3 4 5 6 7蛋白质标质标 准液 (ml)0.2 0.4 0.6 0.8 1.0待测测血清样样本 (ml)1.0 0.9%NaCl(ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0双缩脲试剂缩脲试剂 (ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.
9、0【结果结果】(一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。(二)从标准曲线中查出标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g/L)，并求出人血清样本的蛋白质浓度。(三)从标准管中选择标准管中选择一管与测定管光密度相接近光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g/L)。原始数据记录原始数据记录管号标准管标准管测定管测定管 空白管空白管1234567A A值值0.000日期，室温日期，室温实验项目实验项目实验报告实验报告1 1、实验原理（清晰）、实验原理（清晰）2 2、数据记录及标准曲线、数据记录及标准曲线3 3、实验结果计算（数据带入的过程）、实验结果计算（数据带入的过程）4 4、实验讨论（讨论实验成败的原因，实、实验讨论（讨论实验成败的原因，实 验可改良的地方等）验可改良的地方等） 将原始记录置于最后一页，装订一同上交将原始记录置于最后一页，装订一同上交日期、室温日期、室温实验项目实验项目
