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1、实验二 常见细菌种属的鉴定一、目的要求一、目的要求二、基本原理二、基本原理三、器材三、器材四、操作步骤四、操作步骤五、实验报告五、实验报告一、目的要求1 1、了解常见细菌种属的鉴定程序、了解常见细菌种属的鉴定程序2 2、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法、掌握细菌的生理生化指标鉴定方法二、基本原理（一）微生物分类鉴定的方法（一）微生物分类鉴定的方法多相分类法多相分类法多相分类法多相分类法：Colwell1970Colwell1970年提出，指利用微生物年提出，指利用微生物多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发多种不同的信息，包括表型的、基因型的和系统发育的信息，综合研究微生物分类和系统进化的
2、过程育的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。多相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，。多相分类法几乎包括了现代分类中所有的方面，如传统分类、化学分类、分子分类、数值分类等，如传统分类、化学分类、分子分类、数值分类等，被认为是目前研究各级分类单元最有效的手段，可被认为是目前研究各级分类单元最有效的手段，可用于所有水平上的分类单元的描述和定义。用于所有水平上的分类单元的描述和定义。1、传统分类法也称描述分类，主要指以形态特征、培也称描述分类，主要指以形态特征、培养特征以及生理生化特征等养特征以及生理生化特征等表观表观分类指征，分类指征，对微生物分类单元进行的描述分类。对微生物分类单元进行的
3、描述分类。传统分类是认识微生物实际重要性和研传统分类是认识微生物实际重要性和研究生物进化的基础。究生物进化的基础。是随着信息数字化时代的发展，根据微是随着信息数字化时代的发展，根据微生物分类学信息，应用计算数学原理和技术生物分类学信息，应用计算数学原理和技术辅助定义微生物分类单元的一种方法。辅助定义微生物分类单元的一种方法。主要是向分类学家提供准确的、可重复主要是向分类学家提供准确的、可重复的、大信息量的处理手段。的、大信息量的处理手段。2、数值分类3、化学分类是研究微生物细胞不同化学特性，并利是研究微生物细胞不同化学特性，并利用这些特性对生物个体进行分类和鉴定。用这些特性对生物个体进行分类和
4、鉴定。由于细胞化学成分及分子结构的稳定性由于细胞化学成分及分子结构的稳定性好，因此化学分类是原核微生物系统分类学好，因此化学分类是原核微生物系统分类学的主要方法之一。的主要方法之一。3、化学分类的常用方法uu细胞（壁）化学组分分析细胞（壁）化学组分分析uu枝菌酸分析（诺卡氏菌）枝菌酸分析（诺卡氏菌）uu磷酸类脂分析磷酸类脂分析uu脂肪酸组分分析脂肪酸组分分析uu醌组分分析醌组分分析uu全细胞蛋白全细胞蛋白SDS-PAGESDS-PAGE分析分析uu核糖体蛋白双向凝胶电泳（核糖体蛋白双向凝胶电泳（2D-PAGE2D-PAGE）4、分子分类从分子水平上，对生物个体的从分子水平上，对生物个体的DNA
5、DNA、RNARNA和蛋白质和蛋白质进行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进进行研究，并根据获得的基因型信息对生物个体进行分类的方法。行分类的方法。uuDNA G+DNA G+mol%mol%uuDNA DNA 分子指纹分析分子指纹分析uuDNA-DNADNA-DNA杂交杂交uu核酸序列分析（核酸序列分析（16srDNA16srDNA、ITSITS等）等）（二）微生物的生理生化反应1 1、淀粉水解实验、淀粉水解实验2 2、糖发酵试验、糖发酵试验3 3、MRMR（甲基红）（甲基红）4 4、V-PV-P（伏（伏- -普）普）1 1、淀粉水解实验、淀粉水解实验不同微生物对不同大分子的水解不同微生
6、物对不同大分子的水解能力不同，说明它们有着不同的酶系统能力不同，说明它们有着不同的酶系统。淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细淀粉遇到碘液会产生蓝色，但是细菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生菌水解淀粉的区域，用碘测试不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。蓝色，表明细菌产生淀粉酶。2 2、糖发酵试验、糖发酵试验糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道菌的鉴定上尤为重要。应，在肠道菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有源，但在分解糖类物质的能力上差别很大。有的能产酸和气体，
7、有的只产酸不产气。的能产酸和气体，有的只产酸不产气。发酵产酸时，溴甲酚紫（发酵产酸时，溴甲酚紫（pH6.8pH6.8）变为黄）变为黄色（色（pH5.2pH5.2）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小）。气体的产生可以由倒扣的杜氏小管中有无气泡来证明。管中有无气泡来证明。3 3、MRMR（甲基红试验）（甲基红试验）用来检测由葡萄糖产生的有机酸，用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产酸时，甲基红试剂会由橘黄色（产酸时，甲基红试剂会由橘黄色（6.36.3）变为红色（变为红色（4.24.2），即为甲基红阳性反应），即为甲基红阳性反应。4 4、V-
8、PV-PVP VP试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。此化合物在碱性条件下能被空气中的氧此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白质中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即为的胍基作用，生成红色化合物，即为VPVP试验试验阳性。阳性。uu菌种菌种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌2 2、培养基、培养基固体淀粉培养基、葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基葡萄糖蛋白胨水培养基等3 3、仪器或其他用
9、具、仪器或其他用具三、器材uu淀粉水解试验淀粉水解试验uu将固体淀粉培养基溶化后冷却至将固体淀粉培养基溶化后冷却至5050，无菌操作制成平板。，无菌操作制成平板。uu用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌用记号笔在平板底步划成三部分，将枯草、大肠杆菌、变形杆菌等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。等分别划线接种，并在平板背面标注菌种名称。uu37 37 倒置培养倒置培养24-4824-48小时小时uu观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量观察各种细菌的生长情况。将平板打开盖子，滴入少量LugolsLugols碘碘液，轻轻旋转，使碘液均匀铺满整个平板液，轻轻旋转，
10、使碘液均匀铺满整个平板uu观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以观察菌落周围有没有透明圈出现。透明圈和菌落的直径大小可以初步判断菌体解淀粉的活性。初步判断菌体解淀粉的活性。四、操作步骤2 2、糖发酵试验、糖发酵试验uu用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基名用记号笔在装有糖发酵培养基的试管壁上分别表明培养基名称和所接种的细菌菌名。称和所接种的细菌菌名。uu取葡萄糖发酵培养基试管取葡萄糖发酵培养基试管3 3支，分别接入大肠杆菌、枯草杆支，分别接入大肠杆菌、枯草杆菌、普通变形杆菌，对照不接种。菌、普通变形杆菌，对照不接种。另取乳糖发酵培养基试管另取乳糖发酵培养基试管3
11、 3支，操作同上。支，操作同上。uu接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入接种后，轻轻摇动试管使其混合均匀，防止倒置的小管进入气泡。气泡。uu将接过种的和作为对照的将接过种的和作为对照的6 6支管均置于支管均置于3737培养培养24482448小时。小时。uu观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。观察各试管颜色变化以及杜氏小管有无气泡。3 3、MRMR、VPVP试验试验uu配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。配制蛋白胨水培养基，接种试验菌种。uu培养培养4848小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲小时后，将一支葡萄糖蛋白胨水培养物中加入甲基红试剂基红试剂2 2滴，培养基若变
12、为红色者，为阳性，变黄色者滴，培养基若变为红色者，为阳性，变黄色者为阴性。为阴性。uu取另外一支培养取另外一支培养4848小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加小时后的葡萄糖蛋白胨水培养物，加入入510510滴滴40%40%的的KOHKOH，然后加入等量的，然后加入等量的5%5%的的a-a-萘酚溶萘酚溶液，用力振荡，再放入液，用力振荡，再放入3737温箱中保温温箱中保温15301530分钟，以加分钟，以加快反应速度。培养物呈红色者，为快反应速度。培养物呈红色者，为V-PV-P反应阳性。反应阳性。uu记录实验结果记录实验结果P 118.1P 118.1；P120.1 P120.1 ；P123.1P123.1根据实验结果推测根据实验结果推测1 1、2 2、3 3号菌种分别是何菌？号菌种分别是何菌？uu思考题思考题（1 1）你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？）你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？（2 2）加入某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验是什么结果？）加入某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验是什么结果？（3 3）为什么大肠杆菌是）为什么大肠杆菌是MRMR阳性，而枯草杆菌是阴性？这个实验，与阳性，而枯草杆菌是阴性？这个实验，与V-PV-P试试验最初底物与最终产物有何异同？为什么会不同？验最初底物与最终产物有何异同？为什么会不同？五、实验报告
