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1、毒理学体外试验研究进展毒理学体外试验研究进展摘要随着医学、毒理学研究模式的转变，替代动物实验的体外模型研究成为毒理学发展的重要方向之一。体外毒理学试验是指利用游离器官、培养的细胞或细胞器、生物模拟系统以优化、减少或代替传统的动物实验,进行健康毒理学评价、环境安全性评价和其它相关科学研究。目前应用于毒理学替代的器官或组织主要是胚胎干细胞、肝脏组织、肾脏及皮肤等。不少替代产品已实现商品化供应，一些替代方法已通过有关机构的验证并被欧盟、美国等推广应用。它们都有着良好的发展前景及应用价值。关键词:毒理学；体外实验；应用前景AbstractAlong with medicine, toxicology
2、research pattern transformation, one of substitution animal experimentation in vitro model study into toxicology development important directions.In vitro toxicology experiment is refers using the dissociation organ, the raise cell or the cell organ, the biology analogous system optimizes, the reduc
3、tion or replaces traditional the animal experimentation, carries on the healthy toxicology appraisal, the environment security appraisal and other correlation scientific research.At present applies in the toxicology substitution organ or the organization mainly is the embryo stem cell, the liver org
4、anization, the kidney and the skin and so on.Many substitution product has realized the commercialized supply, some substitution method already through related promoted applications and so on organization confirmation and by European Union, US.They all have the good prospects for development and the
5、 application value.Key word: Toxicology; In vitro experiment; Application prospect毒理学研究的传统方法是进行动物模型的体内试验，成本高、实验周期长，且较难从体液中分离出足量、高纯度的代谢产物进行生物化学和物理化学的研究。而随着新技术的发展，毒理学研究正逐步由体内动物研究向体外试验转变。21世纪的毒性试验及其观念，更多的是伴随着现代技术和社会需求而发展。 现在，以减少、优化和替代为核心的“3R” 理论已愈来愈多的被国际社会所接受。体外试验已成为国际社会法规管理和标准的要求。如今的体外试验已逐渐发展成为庞大的产业。1
6、,2 实验动物替代方法的研究在国外已有40多年的发展历史，而在我国则是刚刚起步。在我国,也有不少高等院校、科研院所、安评和质检机构从事体外试验。体外毒理学评价实验室的组织体外研究通常是在非临床安全评价的框架内,以获得人类健康或环境安全评估数据为目的的试验。因此,体外毒理学实验室多是从事食品原料和添加剂、化学品、生物制品、甚至农药、药品的体外试验。3本文阐述了各类替代物的应用如胚胎干细胞在毒理学研究中的应用、肝脏体外实验模型在毒理学中的应用、皮肤刺激动物实验替代物研究的现状与发展、肾脏体外实验毒理学研究等以及体外试验在毒理学试验方面的应用前景。1 胚胎干细胞在毒理学研究中的应用1.1 胚胎干细胞
7、细胞的生物学特性胚胎干细胞细胞是从哺乳动物早期胚胎分离、经体外培养并分离克隆出来的一种原始、高度未分化细胞,具有能自我复制、更新,并在体外连续传代并保持未分化状态的性能。4可用于药物或化学产品的效能和毒性检测。由于胚胎干细胞细胞的体外分化体系可以模拟胚胎发育过程中细胞与组织间复杂的相互作用,因此胚胎干细胞细胞可能成为毒理学研究的有效工具。1.2 胚胎干细胞的体外培养近年来,经过广泛的应用和研究,欧洲替代方法研究中心推荐了有效性较高的3个体外发育毒性筛选实验,即体外全胚胎培养试验(whole embryo culture ,WEC)、胚胎细胞微团培养试验(micromass culture ,M
8、M)和胚胎干细胞试验(embryonic stem cell test ,EST)作为体外筛选的首选方法。除了作为体外筛选试验外,上述方法还可应用于发育毒性发生机制的研究,通过与整体动物试验相结合,提供有价值的毒性作用资料,并间接减少了所用动物的数量。51.3 胚胎干细胞在毒理学中的应用胚胎干细胞细胞实验主要应用领域是环境污染物、研发药品及农药等化学制剂对人体以及动物胚胎致畸性、细胞毒性等潜在损伤的研究,作为人及哺乳动物发育毒性的体外代替方法6。胚胎干细胞细胞能发展为胚体后的生物系统,可模拟体内细胞与组织间复杂的相互作用,这在毒性研究领域中具有广泛的用途。与体内毒性实验相比,具有更高的灵敏性和
9、准确性,并间接减少了所用实验动物的数量7。除了能评估毒性之外,通过受试物对胚胎干细胞细胞的早期的胚胎阶段到最终分化成特定细胞的全过程的检测,可以对受试物是否具有胚胎毒性做出正确的判断，提高预测的准确度8。利用胚胎干细胞进行毒理学体外实验主要有2种方法:一是利用干细胞迅速生长的特性,用以观察受试物对正在分裂细胞的毒性作用；二是利用胚胎干细胞细胞在体外一定条件下诱导分化成特殊的细胞,用以研究受试物的特殊毒性作用。与不同时间获取的原代细胞相比，干细胞模型的毒性检测结果更具有可比性,数据更可靠。胚胎干细胞细胞为基础的预测毒性检测方法虽不会完全取代在整个动物及人体上的实验,但会使毒性的预测更为精确。1.
10、4 目前胚胎干细胞仍存在的不足及展望由于技术和条件的限制,胚胎干细胞细胞在体外培养的条件从理论上讲还不可能与体内胚胎中的多能细胞的生长条件完全相一致，所以在受试物的作用下,对于干细胞发育的干扰因素及机制的判断与体内结果将出现差异,影响到体外结论向体内的推断,降低了实验结果的可靠性9。目前,胚胎干细胞细胞体外分化为特定类型细胞大多采用诱导剂诱导的方法，但是诱导剂本身可能具有毒性作用，同时诱导剂和诱导方法的使用也因人而异,这对于正确判定受试物可能作用的靶器官,以及对敏感组织细胞产生细胞毒性和抑制分化能力的检测产生偏差,因此如何达到分化细胞特异性与检测结果准确性的平衡,仍需要进一步研究。102 肝脏
11、体外实验模型在毒理学中的应用传统的体内试验在研究外源性化合物致肝损伤时存在一些不足之处11，体外试验在一定程度上弥补了体内试验的缺陷：肝脏毒理学研究中常用的体外试验模型有离体肝脏灌流、肝组织切片和离体肝细胞(肝细胞悬液和原代培养肝细胞)等：离体肝脏灌流最接近体内状态，可用于评价肝脏生理学和形态学改变；肝组织切片保存了肝脏的组织结构，可将细胞毒性检测和组织形态学结合评价肝损伤情况；离体肝细胞则从细胞水平评价化合物代谢和细胞毒性。2.1 肝脏体外试验模型肝脏毒理学研究中较常用的体外试验模型有： 离体肝脏灌流； 精确切取的肝组织切片； 分离的肝细胞，包括肝细胞悬液和原代培养肝细胞； 肝细胞系；遗传工
12、程细胞：此5种试验模型各有优缺点，在进行毒理学试验时应根据试验条件和试验目的正确选择体外试验模型。122.1.1 离体灌流方法，被广泛应用于外源性化学物代谢和肝毒性研究。和其他体外模型相比，离体肝脏灌流最接近体内状态，其最大的优势在于保持了肝组织结构和功能的完整性，可进行短期的代谢动力学试验，但相对其他体外模型而言并没有减少使用的动物数。13132.1.2 肝组织切片与离体肝脏灌流一样，保存了肝脏的组织结构，包含肝组织内所有类型细胞，还保存了完好的细胞基质和细胞间相互作用，其操作较离体肝脏灌流简单1414。与其他体外试验模型相比，肝切片功能异质性和代谢能力比较接近整体器官。肝组织切片，大大减少
13、了使用的动物数15。也可以用人肝切片进行试验，避免了结果由动物向人外推的过程。由于多种动物包括人肝均可制成肝切片进行试验，此种试验模型还可用于种属间比较研究，如有报道用豚鼠肝切片和大鼠肝切片研究对乙酰氨基酚的毒性，发现大鼠肝切片将对乙酰氨基酚代谢为无毒的产物高于毒性产物，豚鼠肝切片GSH耗竭的量效关系比大鼠肝切片明显，生成的毒性产物量也明显高于大鼠肝切片肝切片16。不足之处是胆管系统被破坏，无法收集胆汁进行分析17，另外由于切片存在一定厚度，切片表面肝细胞与内部肝细胞接触的受试物浓度有一定差异。新鲜的肝切片存活时间相对较短，且肝细胞存活率和功能随试验条件不同而有差异。2.1.3 成年大鼠肝细胞
14、分离方法始建于2O世纪60年代，7O年代由Seglen等人进行改进和简化，即如今广泛采用的胶原酶两步灌流法18。在胶原酶灌流液中加人胰蛋白酶抑制剂还可分离出肝细胞对，经离心处理能获得纯度为85的肝细胞对。与离体肝脏灌流相比，肝细胞悬液和肝细胞原代培养均不要求特殊的装置，且能更好地控制营养和激素水平、氧供以及染毒的时间和浓度等试验条件；可摒除血流、细胞类型异质性、神经、体液因素的影响；一个肝脏分离的肝细胞可以制成几十种不同条件的肝细胞悬液或进行不同条件的细胞培养，大大节约了动物数，并可以同时对多种化学物进行量效关系和时效关系研究；细胞存活情况在整个实验过程中易于检测，可对单个细胞进行形态学观察。
15、不足之处在于失去肝小叶结构以及细胞原有的做环境，胆管系统也不存在，因此不能测定肝细胞中代谢产物进入血液或胆汁的排泄情况肝细胞悬液存活时间短，仅(24)h，且细胞功能与培养液的组成密切相关，原代培养肝细胞在一定程度上弥补了这个缺陷19。研究表明将肝细胞与各种凝胶基质进行“三明治”培养或与其他相关细胞进行共培养可以延长肝细胞的存活时间及保持肝细胞功能，扩大了离体肝细胞的应用范围20。目前人工肝细胞培养也有显著进展，在细胞移植、人工肝脏和研究肝脏特定功能尤其是细胞色素P450的表达方面有广泛应用。2.1.4 肝细胞系来源于肝脏肿瘤或转染病毒和细胞DNA的正常肝细胞，其主要特点是细胞数量不受限制。亚细
16、胞组分如经超速离心制备的肝细胞膜、线粒体、细胞核、微粒体等也用于研究外源性化合物致肝损伤，但仅适用于短期研究。遗传工程细胞可用于研究外源性化学物的代谢过程。遗传工程细胞来源广泛，花费较低，且细胞数量不受限制，在研究参与化学物代谢、共价结合、药物抑制的酶有一定作用。18182.1.5 体外试验模型在毒理学研究中也存在一些不足，如毒性反应从体外向体内外推的问题，体外毒性试验难以预测慢性毒性等。上述几种体外试验模型各有优点和局限性，应根据研究目的和具体条件选择适当的方法，结果评定时要充分考虑方法本身的特点和局限性，并与体内试验结果结合进行。需要解决的问题是如何进一步提高各种体外试验模型的存活时间，正确认识并建立各模型间的相互联系近年来，形态学和分子生物学研究手段如免疫组化、RTPCR、Northern blotting、mRNA原位杂交等方法相继与体外试验模型结合，大大扩大了体外试验模型的应用。21212.2 肝脏体外试验模型毒性研究 肝脏体外试验模型毒性
