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1、植植物物生生理理研研究究技技术术实实验验报报告告实实验验二二 叶叶绿绿体体的的分分离离制制备备及及希希尔尔反反应应活活力力测测定定 一、实验目的一、实验目的本实验学习分离制备叶绿体的技术方法，加深对希尔反应的理解及对光反 应的认识。二、实验原理二、实验原理英国生物化学家 RHill(1937 年)首先将离体叶绿体加入有适当氢受体(如草 酸高铁钾盐、2，6 一二氯酚靛酚、NAD+和 NADP+)的水溶液中，照光后即有 O2放出，这就是水的光解，即希尔反应。制备离体叶绿体和测定希尔反应活力 是研究叶绿体结构和光反应必不可少的。 叶绿体的分离采用离心分级分离，即利用叶绿体的直径和沉降系数与其他 细胞
2、器不同的特点，先用低速离心除去细胞碎片，后用高速离心沉降叶绿体。 希尔反应活力的测定是将叶绿体加入铁氰化钾，并照光，水被光解放氧，而溶 液中的 Fe(CN)63-被还原成 Fe(CN)64+，后者可使 FeCl3。变成游离的 Fe2+，而 Fe2+又可与邻菲啰啉盐生成橙红色的络合物，并且 Fe2+的浓度与颜色深浅呈线 性关系，因而可比色测定。其反应如下：三、实验材料、设备和试剂三、实验材料、设备和试剂1实验材料实验材料 新鲜菠菜叶片 2设备设备 (1)分光光度计 (2)台式离心机 (3)研钵 (4)照光装置 (5)试管 (6)移 液管 (7)烧杯 (8)纱布 3试剂试剂(1)叶绿体提取液(ST
3、N)溶液：含有 0.4molL-1蔗糖、0.05 molL-1HCI Tris 缓冲 液、0.01 molL-1NaCl，用 HCl 调 pH 至 7.8，贮于冰箱预冷备用。(2)希尔反应试剂：包括 0.5 molL-1 Tris 缓冲液(pH78)、0.05 molL-1 MgCl2溶液、0.1 molL-1NaCl 溶液、0.01 molL-1K3Fe(CN)6溶液；上述 4 种 溶液单独分装，不能混合。(3)显色试剂：0.01 molL-1FeCl3溶液(用 0.2 molL-1醋酸配制)、0.05 molL-1邻菲啰啉盐酸盐(C12H18N2HClH2O)溶液(先用少量 95%乙醇溶解
4、，后用蒸馏水定容)。(4)亚铁氰化钾系列溶液：10、20、30、40、50molL-1亚铁氰化钾溶液。(5)其他试剂：10%三氯乙酸；0.2 molL-1柠檬酸钠(Na3C6H5O72H2O)溶液；80%丙酮。四、操作步骤四、操作步骤1叶绿体的制备叶绿体的制备先将叶绿体提取液(STN)、洗净的植物叶片和研钵等玻璃器具放入 4冰箱 中预冷备用。然后称取去柄和去脉叶片 10 g 剪碎放在置于冰浴中的研钵内，加 入预冷提取液 20 mL 研磨 2 min(或在组织捣碎机中捣碎 30 s)，再加预冷提取液 2030 mL，4 层纱布过滤，滤液装入刻度离心管，先以 1 500 r/min 离心 1 mi
5、n，上清液转入另一离心管再以 4 000 r/min 离心 4 min，沉淀部分即为叶绿体， 加入少量提取液悬浮沉淀物，并定容至 4 mL，放冰箱备用。以上过程需在 10 min 内完成。 2希尔反应活力的测定希尔反应活力的测定(1)配制反应液：取干洁试管 7 支(编号)，分别加入希尔反应液中的各种试 剂和叶绿体悬浮液各 0.1 mL，再分别加入蒸馏水 0.5 mL，摇匀。(2)照光处理：将 2 支试管放入预先置于方形玻璃标本缸内的有机玻璃试管 架上，缸内注入 20的水保温，另 2 支试管放在暗处作为对照；用 500 W 钨灯 向标本缸内的试管照光 5 min 后，立即向所有试管加入 10三氯
6、乙酸 0.2 mL 终 止反应。摇匀后以 3000 r/min 离心 2 min，上清液用于测定 Fe(CN)64-。(3)比色测定：取离心上清液 0.7 mL，加水 1 mL，再依次加入柠檬酸钠溶 液 2 mL、FeCl3溶液 0.1 mL、邻菲啰啉盐酸盐 0.2 mL，摇匀后室温下暗处静置 20min，于 520 nm 下比色。 3标准曲线绘制标准曲线绘制取干洁试管 7 支(06 号)，分别加入 0(水、空白)、 10、20、30、40、50molL-1亚铁氰化钾系列溶液各 1.7 mL，其他试剂及操作 步骤与样品比色测定相同，记录 OD 值，绘出标准曲线。 4叶绿素含量测定叶绿素含量测定
7、取叶绿体悬浮液 0.1 mL，装入离心管，加入 80%丙酮 4.9 mL，摇匀后以 4000r/min 离心 5 min，取上清液于 652 nm 下比色，记录 OD 值，并用 Arnon 公 式计算叶绿素含量五、注意事项五、注意事项1三氯化铁和邻菲啰啉盐酸盐配制后应放在棕色瓶中。 2测定希尔反应时尽量避光，尤其是加入邻菲啰啉盐酸盐后应在暗处静置，方 才比色。六、结果处理六、结果处理 式中：A 一一希尔反应活力molL-1K4Fe(CN)63- (mg 叶绿素h-1)；b 一一标准曲线查得 Fe(CN)64-(mol)；f 一一叶绿体悬浮液叶绿素含量(mgmL-1)；d 一一 1.2 mL(反
8、应液 1 mL+三氯乙酸 0.2 mL)；m 一一 0.7 mL(测 Fe(CN)64-所用体积)；n 一一 0.1 mL(反应液中叶绿体悬浮液体积)；t 一一反应时间(h)。根据本测定的第一个反应式可以看出，每还原 4 mol Fe3+可释放出 1 molO2。因此上 述计算结果除以 4，即为以 O2表示的希尔反应活力 molL-1 (mg 叶绿素h-1)。叶绿素含量由公式得叶绿素含量由公式得=0.3781.449=0.548 mgmL-1Fe(CN)64- 的浓度的浓度 比色测定 暗处 0.103 光照 0.686 由标准曲线得 Fe(CN)64- 的浓度 12.835mol标准曲线y =
9、 0.0388x + 0.085 R2 = 0.99190.0000.5001.0001.5002.0002.5000102030405060 亚铁氰化钾浓度OD值希尔反应活力希尔反应活力=33.459molL-1K4Fe(CN)63- (mg 叶绿素h-1)七、讨论七、讨论1.在研磨样品时，共取菠菜叶片 10g，加入 20ml 的预冷缓冲液时，由于剪取样本时为充分将其剪碎导致在磨样过程中比较难磨碎,且磨样过程时间太长，期间叶绿素会分解一部分。2.加预冷缓冲液时一次加完，这样会导致无法用预冷的缓冲液彻底的冲洗研钵。3.每一小组样本间没有重复，导致数据结果准确度和可信度不高。4.标准曲线和样本测定所用分光光度计的不同以及两套比色皿的混用，造成数据可能不准确。
