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1、植物快速繁殖和脱毒植物快速繁殖和脱毒 植物快速繁殖就是应用组织培养技术，快速繁殖名优特新品种，使其在较 短时间内繁衍较多的植株；快速繁衍珍稀濒危植物，使物种得以保存。快速繁 殖是当前植物细胞工程中应用最广泛，又最有效的方法之一。除了一部分豆类作物外，种子是不会传递病毒的。植物病毒是通过无性繁 殖传递的，而快速繁殖是建立在无性繁殖的基础上，病毒在母体内逐代积累， 危害越来越严重。目前在生产上尚无特效药物可彻底除去病毒，而快速繁殖却 可以，因此，快速繁殖脱毒显得非常重要。一、植物快速繁殖的途径和方法以植物的根、茎、叶柄和花等片段以及孢子作为外植体，或者切取茎尖、腋 芽进行离体培养，可以直接诱导器官
2、分化，产生芽、根，也可以诱导改变原有 的 分化状态，脱分化形成愈伤组织，再经过不同的细胞分化途径重建形成不 同的器官，直到完整植株。(P86 L.1L.16)植物快速繁殖的类型与方式可归纳如下表： 类型方 式特 点事 例器官型腋芽萌发，以芽增 殖芽，扩大繁殖系 数繁殖系数高，一转 性较稳定，是快速 繁殖的主要方式甘蔗、香蕉、香石 竹、丝石竹等器官发生型通过脱分化形成愈 伤组织，再分化出 苗可获得与母株相同 的小植株，繁殖系 数较低，可用于细 胞分化的研究烟草、油菜等胚状体发生型从愈伤组织或直接 从子叶、下胚轴和 花药培养中产生首先证明植物细胞 的全能性，繁殖系 数高甘蔗、胡萝卜、石 刁柏等原球
3、茎型由茎尖或腋芽产生 原球茎放入培养基 中发育成小植株遗传性较稳定，原 球茎可作为繁殖系 母体兰花球茎芽型叶柄表面产生圆球 形小突起球茎 芽，一端出芽一端 出根遗传性较稳定，球 茎芽可直接放入土 中种植观叶海棠块茎型叶片或叶柄上形成 粒状芋块，进一步 分化出芽和根块茎芽可为繁殖系 母体，不断切割繁 殖移栽，成活率高花叶芋鳞茎型鳞片近轴面或边缘 直接形成带根的小 鳞茎在试管内形成小鳞 茎需较长时间百合、郁金香、贝 母等孢子型用成熟或未成熟的 孢子进行培养孢子繁殖最困难的 是表面消毒，萌发 时间较长地钱、狼尾蕨等根茎型蕨类具有横向的茎 及直立的短根茎， 为组织培养的最佳 外植体根状茎上产生蕨叶 及
4、根，繁殖速度较 孢子型快肾蕨、裂叶肾蕨、 波士顿蕨等微枝扦插型带芽的小插条在试 管内进行无菌扦插为木本植物进行快 速繁殖的主要方式葡萄、杨树快速繁殖中茎尖培养脱毒无病毒苗的获得：（一）材料的培养和灭菌为了获得无菌的茎尖，应把供试植株种在无菌的盆土中，放在温室栽培。浇 水要浇在土中，不要浇在叶片上。如材料取自田间，可切取插条，在实验室内 进行溶液培养。由这些插条的腋芽长成的枝条，其污染程度比直接从田间植株 取来的枝条少得多。自外，定期喷施内吸杀菌剂（如 0.1%多菌灵和 0.1%链霉素） 也十分有效。（二）茎类剥离取幼苗茎尖 23cm 小段，剥去可见的大叶，放在烧杯内用自来水冲洗 1h 左 右，
5、移入无菌室进行严格消毒。先用 95%酒精快速浸泡一下，再放入 5%的漂白 粉溶液内消毒 710min（也可用市场上出售的次氯酸钠溶液稀释为 5%），然后 用无菌水 冲洗 34 次，在双筒解剖镜下一手用细镊子将茎芽按住，另一手用 解剖针仔细地将幼叶剥去，最后露出圆滑的生长点，用注的针头侧刃或自制的 解剖针，仔细地切取带有 12 个叶原基的生长点，随即接种到试管培养基上进 行培养。这样外植体（生长锥带 12 个原叶基）的培养，严格来说，应称为分 生组织培养。以上操作必须严格在无菌条件下的超净工作台中进行，所用器具都应浸泡于 70%的酒精中，使用前要在究竟灯上烧灼灭菌，注意不使解剖针、刀太烫，以免
6、损伤组织。解剖镜台应垫载玻片，每剥离一个茎尖应以酒精棉团擦拭，手也应 经常用 70%酒精擦试。茎尖很幼嫩，暴露时间越短约好。因为超净台的气流和 酒精灯发出的热都会使茎尖迅速变干。（三）茎尖培养目前常使用的的基本培养基是 MS 培养基或 White 培养基，它有较高浓度的 无机盐，对促进组织分化和愈伤组织生长是有利的。在培养基中可酌情添加 5%10%椰乳，0.11.0mg/L 的吲哚乙酸、萘乙酸、苄基腺嘌呤等，有的还需添加活性炭。根据培养种类不同，添加的生长调节剂可适当调整。（P92P93 L.11）茎尖培养的生长可能有 4 种类型： 组织不增大，不久变褐死亡，这可能 是生长点受伤所致。 组织渐
7、变绿，但体积增大缓慢，可把组织转到 NAA 浓 度高于 0.05mg/L 的培养基上，并提高温度以加速其生长。 组织基部不产生 或 少量产生愈伤组织，而生长点发育正常，一个月内可形成无根的小植株， 这是最理想的情况。当长有 23 片西欧啊叶时，应把小植株转到无生长素的培 养基上，促进生根。 茎尖基部产生大量愈伤组织而生长点很少伸长，不理 想。这时应把这些愈伤组织转移到无生长素的培养基上，并降低培养温度，以 抑制愈伤组织生长促进其分化。（P94P95 L.2）（四）提高脱毒效果感染了病毒的蜘蛛在切取茎尖进行培养之前，进行高温处理、低温处理或化 学处理，可以提高脱毒效果。1. 高温处理又称温热疗法
8、。某些病毒受热以后不稳定，失去活性。根据这个原理，把植物放在高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热 后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。高温处理有两种方法：（1）汤浸渍处理，适用于切下的材料，在 50C 左右的温水中浸渍数分钟 至数小时，方法简便易行但易致材料受伤。（2）热风处理，将生长的盆栽植物移入室内或生长箱内，处理温度和时间因 植物种类和器官生理状况而异。一般为 3540C，短则几十分钟，长可达数月。（P95 L.3L.15）每一种植物高温处理有他的临界温度，超出这个温度或温度虽在此范围内但 处理时间过长，组织就受伤。可以采用变温方法，即每天 40C 处理 4 h，1
9、620C 处理 20 h，这样，既可保持芽眼的活力，亦可清除芽眼中幼叶的 病毒。2. 低温处理，亦称冷疗法。菊花植株在 5C 条件下分别处理 4 个月或7.5 个月，没有菊花矮化病毒（CSV）的无病毒苗分别是 67%和 73%，而 没有菊花褪绿斑驳病毒（CCMV）的无病毒苗分别是 22%和 49%，未经处 理的茎尖则无脱毒效果。3. 化学处理，又称化学疗法。一些化学药品如嘌呤和嘧啶；类似物、氨基酸、抗生素处理，可在某种程度上抑制植物体内或离体叶片内病毒的合成，但仍不能是病毒失活。近年发现三氮唑核苷（1D呋喃 核糖1，2，4三氮唑）用于防治一系列动物 DNA 和 RNA 病毒，对植 物也有效。将
10、感染了马铃薯 Y 型病毒（PVY）、黄瓜花叶病（CMV)或烟草 花叶病毒（TMV）的叶柄，培养在三氮唑核苷的 MS 培养基上，子代植株 则除去病毒，而对照则无效，说明三氮唑核苷抑制病毒的增殖。其他途径脱毒（一）愈伤组织脱毒感染病毒的愈伤组织细胞并非全部都含有病毒。例如已经感染 TMV 的烟草 愈伤组织，经机械分离后，发现仅有 40%细胞含有病毒。用感染 TMV 的烟草髓 部愈伤组织诱导出的愈伤组织，继代四次后用荧光抗体法检验，几乎不存在病 毒。从马铃薯茎尖培养产生植株概率。许多试验也报道，从有病毒的草莓、唐 菖蒲、老鹳草、大蒜、火葱、款冬等的愈伤组织中，都分化出无病毒的植株。 以上事实，可能因
11、为细胞增殖速度快过病毒复制速度，或者细胞产生变异，获 得对病毒感染的抗性，最终表现出脱毒现象。（二）珠心胚培养脱毒柑橘类多胚品种中除了一个受精胚以外，尚有多个由珠心细胞形成的无性胚， 称为珠心胚。珠心胚与维管束系统无联系，因此由珠心胚产生的植株全部均无 病毒。但珠心胚 大多是不育的，必须分离培养才能发育成正常的幼苗。珠心胚 培养技术对除去柑橘主要病毒，如引起银屑病、叶脉突出病、柑橘裂皮病、柑 橘速衰病等的病毒，都十分有效。（三）茎尖微体嫁接脱毒木本植物茎尖培养难以生根形成植株。为了克服这个困难、可将实生苗砧木 培育在培养基上，再从成年无病毒树枝上切取茎尖（0.141.0mm），在砧木切 断 面
12、上进行试管微体嫁接，就可获得无病毒的幼苗。利用这个方法，柑橘类 嫁接成活率为 30%50%，移栽成活率约 95%，嫁接两年后即可结实。应用这个技 术，可获得柑橘类没有银屑病植株、桃树没有洋李环斑病毒、洋李矮缩病毒、 褪绿叶斑病毒的无病毒苗。（四）培育抗病毒栽培种上述各法可以脱毒，但最有效的方法还是培育抗病毒的栽培种，可以一劳永 逸。可采用导入抗病毒的原生质体融合技术，得到抗病毒的杂交种。例如烟草 和黄花烟草（N.rustica）原生质体融合，得到的细胞杂交种，对 TMV 有抗性； 马铃薯栽培种与野生种（S.chanocoense）有性杂交产生的后代，可抗 PVY 的感 染。脱毒苗的鉴定利用生长
13、点培养无毒苗的成苗率和脱毒率都非常低，有时无毒株只占千分之 几。因此，每一茎尖分化产生的植株，在作为母本生产无病毒原种以前，必须 进行特定病毒鉴定。由于在培养的植株中许多病毒具有延迟的恢复期，所以在 最初 18 个月中每隔一定时间仍需进行鉴定。只有对待病毒显示持续阴性反应的 无病 毒植株，才能进一步扩大繁殖。无病毒植株容易再被感染，因此在繁殖 的不同时期仍需重复进行鉴定。常用的鉴定法有直接测定法、指示植物法、抗 血清鉴定法和电子显微镜检查法等。（一）直接测定法直接观测植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状。下表是马铃薯几种主要病 毒的病状，供参考。然而寄主植株感染病毒后需要较长的时间才出现症状，有
14、 的并不能使寄主植物出现可见的症状，因此需要更敏感的测定方法。几种马铃薯病毒种类的症状 种 类症 状鉴定寄主马铃薯 X 病毒，PVX脉间花叶千红日、曼陀罗、辣椒、 番茄、心叶烟马铃薯 S 病毒，PVS叶脉深陷粗缩苋色藜、千日红、光曼陀 罗、昆诺阿藜 （Chenopodium quinoa）马铃薯 Y 病毒，PVY随品种而异，有些轻微花 叶或粗缩，敏感品种反应 为坏死野生马铃薯、洋酸菜、曼 陀罗马铃薯卷叶病毒，PLRV初浸染幼叶尖呈浅黄白色， 有些品种呈紫色或红色洋酸菜（二）指示植物法利用病毒在其植株上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。这种专用以产 生症状的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。指示
15、植物分为两种类型：一种早 接种后产生的症状可扩张到非接种部位；另一种只在接种部位产生病斑。接种 时取待测植物的幼叶，加少量水及等量 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH 值 7.0），磨 成匀浆，吸取少量浆液揩抹在事先涂有 500600 目金刚砂（有利于破损叶片表 面细胞）部分，轻轻摩擦务使浆液能侵入叶片表皮细胞但又不损伤叶片。5 分 钟后用水冲洗叶面。将被接种的指示植物置于有防蚜虫网罩的温室内，1525， 如接种植物的浆液含有病毒，数天至几周后，指示植物即出现可见的症状。较 常用的指示植物有苋色藜（Chenopodium amaranticolor）、昆诺阿藜 (C.quinoa)、千日红(G
16、omphrena globosa)和各种烟草等。（三）抗血清鉴定法植物病毒是由核酸和蛋白质组成的核蛋白复合体，因而也是一种抗原，注射 到动物体内即产生抗体，抗体存在于血清之中，称为抗血清。由于不同病毒产生的抗血清都有特异性，用特定病毒的抗血清来鉴定该种病毒，具有高度专一 性和 特异性，几分钟至几小时即可完成，方法简便，所以成为植物病毒鉴定 中最有用的方法之一。抗血清鉴定首先要进行抗原的制备，只有获得高纯度的 抗原，才有可能获得高度纯净的抗血清。抗血清的鉴定法主要根据沉淀反映原 理，具体测定有试管沉淀、凝聚试验、免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和 酶联免疫吸附试验等多种方法。（四）酶联免疫吸附法这是用酶标记抗原或抗体的微量测定方法。将抗体固定在支持物上，加入待 检植物组织提取液，然后加入酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）标记的抗体，再 加入底物经酶催化，吸收波长发生变化，因而可用分光光度计鉴定。此法灵敏 度极高，检测大量样本时特别实
