重组技的基本工具

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1、 一、在基础理论上取得重大突破1.DNA是遗传物质的证明2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立3.遗传密码的破译 二、技术发明使基因工程的实施成为可能1.基因转移载体的发现2.工具酶的发现3.DNA合成和测序技术的发明4.DNA体外重组的实现5.重组DNA表达实验的成功6.第一例转基因动物的问世7.PCR技术的发明该技术就是按照人们的意愿，把一种该技术就是按照人们的意愿，把一种 生物的某种基因提取出来，生物的某种基因提取出来，加以改造加以改造，然，然 后放到另一种生物的细胞里，后放到另一种生物的细胞里，定向地改造定向地改造 生物的遗传性状生物的遗传性状。又叫。又叫基因拼接技术基因拼接技术或或 D

2、NADNA重组技术重组技术。（一）基因工程的概念（一）基因工程的概念目的性强，定向改变生物，培育新品种；能克服生物远源杂交不亲合障碍。 优点 ：基因工程的别名基因工程的别名操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平基本过程基本过程实质实质结果结果基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的基因产物人类需要的基因产物剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达基因重组基因重组 基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花( (无抗虫特性无抗虫特性) )苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫

3、基因抗虫基因与与运载体运载体DNADNA拼接拼接导入导入棉花细胞棉花细胞( (含含抗虫基因抗虫基因) )棉花植株棉花植株( (有有抗虫特性抗虫特性) )1:1:提取抗虫基因需要提取抗虫基因需要: :基因的剪刀基因的剪刀限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2:2:抗虫基因与运载体抗虫基因与运载体DNADNA连接需要连接需要: :基因的针线基因的针线DNADNA连接酶连接酶3:3:抗虫基因导入受体抗虫基因导入受体( (棉花棉花) )细胞需要细胞需要: :基因的运载工具基因的运载工具运载体运载体1. 1. 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀” ”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶( (

4、简称限制酶简称限制酶) ) 是在生物是在生物 体体( (主要是主要是微生物微生物) )内的一种酶，能将外来的内的一种酶，能将外来的 DNADNA切断切断。由于这种切割作用是在。由于这种切割作用是在DNADNA分子内分子内 部进行的，故名限制性核酸内切酶。部进行的，故名限制性核酸内切酶。特点：特点：特异性特异性。即即一种一种限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶( (简称限制酶简称限制酶) )， 只能识别一种只能识别一种特定的特定的核苷酸序列核苷酸序列，并且能在，并且能在特特 定的切点定的切点上切割上切割DNADNA分子。分子。（二）（二）DNADNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具限制性核酸内限

5、制性核酸内 切酶切割点切酶切割点限制限制 酶酶大肠杆菌大肠杆菌( (E.coliE.coli) )的一种限制酶的一种限制酶能识别能识别 GAATTCGAATTC序列序列，并在，并在GG和和A A之间切开。之间切开。黏性末端黏性末端：指被限制酶切开的：指被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口两条单链的切口 上所带有几个上所带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸。游离片段游离片段 要想获得某个特定的基因必须要用限制酶切要想获得某个特定的基因必须要用限制酶切 几个切口？可产生几个黏性末端？几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。 如果把两种来源不同的

6、如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端。然后让两者的。然后让两者的 黏性末端黏性末端黏合黏合起来，就可以合成重组的起来，就可以合成重组的DNADNA 分子。分子。2. DNA2. DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针” ”DNADNA连接酶连接酶可把黏性末端可把黏性末端之间的缝隙之间的缝隙“ “缝缝 合合” ”起来。即把梯子两边扶手的断口连接起来起来。即把梯子两边扶手的断口连接起来 ，这样就形成了一个重组的，这样就形成了一个重组的DNADNA分子。分子。 外源基因外源基因( (如抗虫基因如抗

7、虫基因) )怎样才能导入受体细怎样才能导入受体细 胞胞( (如棉花细胞如棉花细胞) )？导入过程需要运输工具导入过程需要运输工具运载体运载体。 运载体的作用有哪些？运载体的作用有哪些？作用作用1 1：作为运载工具，将外源基因：作为运载工具，将外源基因( (抗虫基抗虫基 因因) )转移转移到受体细胞到受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )中去。中去。作用作用2 2：利用运载体在受体细胞：利用运载体在受体细胞( (棉花细胞棉花细胞) )内内 ，对外源基因对外源基因( (抗虫基因抗虫基因) )进行进行大量复制大量复制。作为运载体必须具备哪些条件？作为运载体必须具备哪些条件？1 1）能够在宿主细胞中）能

8、够在宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地保存保存2 2）载体）载体DNADNA必须必须有一个或多个限制酶切点有一个或多个限制酶切点，以便，以便 于目的基因插入载体中于目的基因插入载体中3 3）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行筛选筛选，如对抗菌素，如对抗菌素 的抗性基因的抗性基因 4)4) 载体载体DNADNA必须是必须是安全的，不会对受体细胞有害，安全的，不会对受体细胞有害， 或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 5)5) 5) 5) 载体载体DNADNA分子大小应适合分子大小应适合，以便提取和在体，以便提取和在体 外进行操作

9、，太大就不便操作外进行操作，太大就不便操作3. 3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车” ” 常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类：1 1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒2 2） 噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物和和动植物病毒动植物病毒质粒是能够质粒是能够自我复制自我复制的小型的小型环状环状DNADNA分子。分子。现在现在 专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的核以外的DNADNA分分 子子。是基因工程。是基因工程最常用最常用的的运载体，常需人工改造。运载体，常需人工改造。 大肠杆菌的质粒：大肠杆菌的质粒：最常用的质粒

10、最常用的质粒 是是大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒 ，常含有，常含有抗药性基抗药性基 因因，如四环素抗性，如四环素抗性 基因、氨苄青霉素基因、氨苄青霉素 抗性基因等标记基抗性基因等标记基 因。质粒的因。质粒的存在与存在与 否对宿主细胞生存否对宿主细胞生存 没有决定性作用没有决定性作用， 但但复制只能在宿主复制只能在宿主 细胞内完成细胞内完成。双基练习：双基练习： 1. 1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀” ”(1)(1)主要来源主要来源: :从从_生物中分离出来的生物中分离出来的(2)(2)特点特点: :能够识别能够识别DNADNA特定的核苷酸序列，切开特定的核苷酸序列，切

11、开两个两个 _之间的之间的_ 。(3) DNA(3) DNA末端末端: :限制酶切割限制酶切割DNADNA产生的产生的DNADNA末端有两末端有两 种形式种形式:_:_和和_。 2. DNA2. DNA连接酶连接酶“分子缝合针分子缝合针” ”(1)(1)作用作用: :将双链将双链DNADNA片段片段 ，恢复被限制，恢复被限制 酶切开的两个核苷酸之间的酶切开的两个核苷酸之间的_。(2)(2)种类种类: :E.coliE.coli DNA DNA连接酶连接酶: :只能缝合只能缝合DNADNA的的 。T T4 4 DNADNA连接酶连接酶: :既可缝合既可缝合DNADNA的的_，又可缝合，又可缝合

12、双链双链DNADNA的的_。“缝合”起来原核核苷酸磷酸二酯键黏性末端 平末端磷酸二酯键黏性末端 黏性末端 平末端3. 3.基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体“分子运输车分子运输车” ”(1)(1)载体的种类载体的种类质粒质粒: :是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟 核核DNADNA之外，并具有之外，并具有 能力的双链能力的双链_ _ DNA DNA 分子；分子；_ _ 的衍生物；的衍生物；_。(2)(2)载体的特点载体的特点能够在受体细胞内能够在受体细胞内_。有一个或多个有一个或多个 切割位点，供外源切割位点，供外源DNADNA 的插入。的插入。

13、具有具有 ，供重组，供重组DNADNA的鉴定和选择。的鉴定和选择。标记基因自我复制环状噬菌体动植物病毒自我复制限制酶4可用于基因工程载体的DNA分子( )。 A细菌DNA B病毒DNA C噬菌体DNA D质粒DNA5细菌质粒特征包括( )。 A能独立自我复制的线形DNA分子 B含有1050个基因的小型、结构简单的DNA分子 C细菌存活所必需的成分 D能从一个细菌转移到另一个细菌BCDBD6已知某种限制性内切酶在一线线性DNA分子上有3个酶切位 点，如图图中箭头头所指。如果在该线该线 性DNA分子在3个酶切位点 上都被该该酶切断，则则会产产生a、b、c、d四种不同长长度的DNA片 段。现现有多个

14、上述线线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1 个酶切位点被该该酶切断，则则从理论论上讲讲，经该经该 酶酶切后，这这些 线线性DNA分子最多能产产生长长度不同的DNA片段种类类数是（ ） A3 B4 C9 D12C有这样一些可能：a b c d b+c+d a+b c+d a+b+c b+c 7、在DNA测测序工作中，需要将某些限制性核酸内切酶的限制位点在 DNA上定位，使其成为为DNA分子中的物理参照点，这项这项 工作叫做“限 制酶图谱图谱 的构建”。假设设有以下一项实验项实验 ：用限制酶Hind、 BamHI和二者的混合物分别别降解一个4 kb(1 kb即1千个碱基对对)大小 的线线性DNA分子，降解产产物分别进别进 行凝胶电电泳，在电场电场 的作用下， 降解产产物分开，如下图图所示。据此分析，这这两种限制性核酸内切酶 在该该DNA分子上的限制位点数目是 ( )AHind 1个，BamHI 2个 BHind 2个，BamHI 3个 CHind 2个，BamHI 1个 DHind 和BamHI各有2个A