微生物指标及微生物检验

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1、生活饮用水卫生标准GB5749-2006生活饮用水标准检验方法GB5750-2006微生物指标及微生物检验的介绍广东省CDC微生物检验所 严纪文我国旧的饮用水水质标准是1985年颁布实施的GB5749- 85，标准检验方法为GB5750-85。该标准与国外的饮用水标准相比，主要差别在于微生物指标项目少，缺少有机 物和消毒副产物指标。微生物指标只有细菌总数和总大肠 菌群2项，不能确切的评价水质的卫生状况。修订后的标准，微生物学指标增加为6项：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和 隐孢子虫。同时在资料性附件中增加了肠球菌和产气荚膜梭状芽胞杆 菌。水质常规指标及限值修订订前

2、修订订后微生物指标标限值值微生物指标标限值值细细菌总总数100 CFU/mL菌落总总数/（CFU/mL）100总总大肠肠菌群每100mL水样样中不得检检 出总总大肠肠菌/（MPN/100mL 或CFU/100mL）不得检检出粪粪大肠肠菌群每100mL水样样中不得检检 出耐热热大肠肠菌/（ MPN/100mL或CFU/100mL ）不得检检出游离余氯氯在与水接触30min后应应不 低于0.3mg/L,管梢末水不 应应低于0.5mg/L大肠肠埃希氏菌/（ MPN/100mL或CFU/100mL ）不得检检出水质非常规指标及限值修订订前修订订后 微生物指标标限值值微生物指标标限值值-菌落总总数/（C

3、FU/100mL）500小型集中式供水和分散式供水部分水质指标及限值修订订前修订订后 微生物指标标限值值微生物指标标限值值-贾贾第鞭毛虫/（个/10L）1-隐孢隐孢 子虫/（个/10L）1生活饮用水水质参考指标及限值修订订前修订订后微生物指标标限值值微生物指标标限值值-肠肠球菌/（CFU/100mL）0-产产气荚荚膜梭状芽胞杆/（CFU/100mL）0一、菌落总数修订订前修订订后 细细菌总总数 原理：细细菌总总数是指水样样在一定 条件下培养后（培养基成分、培 养温度和时间时间 、pH、需氧性质质等 ）所得1ml水样样所含菌落的总总数 。按本规规范规规定所得结结果只包括 一群能在营营养琼琼脂上发

4、发育的嗜中 温的需氧的细细菌菌落总总数培养条件：361 24h 菌落总总数 定义义：水样样在营营养琼琼脂上有氧条 件下37培养48h后，所得1ml水 样样所含菌落的总总数。361 48h 二、总大肠菌群（埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷 伯氏菌属、肠杆菌属）除多管发酵法、滤膜法外，增加了酶底物检测方法多管发酵法修订订前修订订后多管发发酵法原理：总总大肠肠菌群系指一 群在37 培养24h能发发酵乳糖、产产酸 产产气、需氧和兼性厌厌氧的革兰兰氏阴性 无芽胞杆菌。该该菌群主要来源于人畜 粪粪便，具有指示菌的一般特征，故以 此作为粪为粪 便污污染指标评标评 价饮饮水的卫卫 生质质量。总总大肠肠菌群定义义

5、：总总大肠肠菌群指一 群在37 培养24h能发发酵乳糖、产产酸 产产气、需氧和兼性厌厌氧的革兰兰氏阴 性无芽胞杆菌。结结果：5个10ml 管中阳性管数为为0时时 ，MPN值为值为 0（主要针对针对 出厂自来水 或需每天检验检验 一次的水样样） 结结果：5个10ml 管中阳性管数为为0时时 ，MPN值值2.2 滤膜法 修订订前修订订后滤滤膜法原理：用孔径为为0.45m 的微孔滤滤膜过滤过滤 水样样,细细菌被截 留在滤滤膜上,将滤滤膜贴贴在选择选择 培 养上,经经培养后,计计数生长长在滤滤膜 上的典型大肠肠菌群菌落数。 培养条件：37 18-24h 滤滤膜法定义义：总总大肠肠菌群滤滤膜 法是指用孔

6、径为为0.45m的微孔 滤滤膜过滤过滤 水样样, 将滤滤膜贴贴在添加 乳糖的选择选择 培养上, 37 培养 24h，能形成特征菌落的需氧和 兼性厌厌氧的革兰兰氏阴性无芽胞杆 菌以检测检测 水中总总大肠肠菌群的方法 。 培养条件：37 242h 酶底物法 酶底物法定义：总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生-半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使 培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。 培养基：MMO-MUG培养基（Minimal Medium ONPG-MUG）。本方法可分为定性和定量。 定量法：10管法、51孔定量法 培养条件： 361 24h

7、能产生-半乳糖苷酶的细菌群组分解ONPG使培养基呈黄色酶底物法的主要特点： 优点： 可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌 检测时间较短，只需18-24h，最长需要28h 无需确证试验 操作简单，对试验条件和人员要求低 缺点： 检测成本高总大肠菌群三种方法的比较多管发发酵法滤滤膜法酶底物法时间时间24-72h24-48h24-28h验证试验验证试验需要需要不需要步骤骤较较繁较简较简 便简简便特殊设备设备显显微镜镜显显微镜镜、过滤设备过滤设备压压膜机价格低低较较高三、耐热大肠菌群（埃希氏菌属、耐热克雷伯氏菌）检测方法：多管发酵法、滤膜法修订订前修订订后原理：用提高培养温度的方法将自 然环环境中的

8、大肠肠菌群与粪粪便中大 肠肠菌群区分开，在44.5仍能生长长 的大肠肠菌群,称为粪为粪 大肠肠菌群。 定义义：用提高培养温度的方法将自 然环环境中的大肠肠菌群与粪粪便中大 肠肠菌群区分开，在44.5仍能生长长的大肠肠菌群,称为为耐热热大肠肠菌群。 四、大肠埃希氏菌检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法 大肠埃希氏菌多管发酵法定义：大肠埃希氏菌是指多管发酵法总大肠 菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5培养24h产生-葡萄糖酫酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征 性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：EC-MUG（4-甲基伞形酮-D-葡萄糖酫酸苷）

9、。 培养条件：44.50.5 培养242h。紫外灯：波长366nm，功率6W 大肠杆菌能产生-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下产生蓝色荧光 滤膜法定义：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜 在含 有荧光底物的培养基上培养，能产生-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测 水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：NA-MUG 培养条件：361 培养4h 紫外灯：波长366nm，功率6W 酶底物法定义：在选择培养基上能产生-半乳糖苷酶分解 色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生 -葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌

10、落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏 菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。培养基：ONPG-MUG结果判定：水样变黄色同时在366nm的紫外光下产生蓝色荧光为阳性。水样未变黄色而有蓝色荧光产生不能判定为 阳性。五、贾第鞭毛虫子和隐孢子虫贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体内的肠道原虫，可致人兽共患病。患此病的人和动物 从粪便中排出大量的卵(孢)囊污染环境，在地面水和防 护差的地下水及处理不良的自来水中都可检出卵(孢)囊。随着社会发展，优质供水势在必行。对一些潜在的 危险因素加以限制很有必要。在此基础上，新标准中 增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测方法。Cryptospori

11、dium 隐孢子虫 特点:单一细胞原生动物，约3-7m 。有微小隐孢子虫、 鼠隐孢子虫和贝氏隐孢子虫三种，寄生于人、牛等体内的主 要为微小隐孢子虫（Cparvum）。 宿主：人类、鸟类、鼠类、爬行类、鱼类 感染源:隐孢子虫主要寄生在被感染的动物体肠道内，卵囊 通过粪便排出体外污染环境。 易感人群：免疫缺陷者（如爱滋患者）、儿童、老人、医 务人员等 传播方式:以粪-口，手-口途径为主，污染的水源和空气均 可传播。Cryptosporidium 隐孢子虫生活周期子孢子滋养体型裂殖体裂殖子型裂殖体雌、雄配子体合子成熟卵囊裂殖子Cryptosporidium 隐孢子虫(染色后荧光显微镜下)特点:单一细

12、胞原生动物，大小约10-15m，含4对鞭毛和 双核。人、动物共染。寄生人体内为蓝氏贾第鞭毛虫 Giardia lamblia。在不同温度和纬度地区均能发现该病 ；发达国家感染率为2-5%；发展中国家感染率可高达到 20-30%。 可引起急慢性腹泻、肠吸收紊乱及延缓儿童的 生长发育。传染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人带孢囊全家 感染；传播:通过被污染的水和食物经口传播；接触（往往一人 带孢囊全家感染）；娱乐用水；旅游。易感人群：3岁以内婴儿；免疫功能受损害者；旅游者。Giardia 贾第鞭毛虫重要的动物宿主 贾第鞭毛虫在自然界广泛存在，包括两栖动物；鸟类 ；哺乳动物在内的40多种动物均可成为

13、贾第鞭毛虫的宿 主。 调查表明，人排出孢囊可使狗、海狸、麝鼠、沙土鼠 及大鼠等动物感染。 一些生活在水中的动物可被来源于人的贾第鞭毛虫孢 囊感染，因此这些动物即使不是主要宿主也可能作为贾 第鞭虫的传播媒介。Giardia 贾第鞭毛虫两虫感染的特点 贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium) / 感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素无 效，治疗依赖于自身抵抗力 大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的,大部 分地下水都有被地表水污染的潜在危险 可以通过被污染的源水而进入供水系统,水源性感染已成 为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯化消 毒

14、有抗性,氯不能渗透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能完 全去除 饮用水高温煮沸也并非有效 对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高隐孢子虫感染案例1993 年在美国威斯康星州的东南 部港口城市密尔沃基暴发 400,000 人被Cryptosporidium感染，4,000人到 医院 就医，60人死亡。调查显示致病源为处理不慎的饮 用水。1996 年美国CDC将 Cryptosporidium感染列入国家必 须申报的传染病名单，2002年将 Giardia 感染列入国家 必须申报的传染病名单U.S.EPA两虫的检测方法（免疫磁分离荧光抗体法）检测程序：水样过滤 洗涤 离心 免疫磁珠捕获卵囊 磁珠与

15、卵囊复合物的分离 荧光标记和DAPI染色 显微镜检查记述 结果报告检测问题： 方法操作复杂 检出率低 无法进行生物活性判定 不能进行属、种鉴定 价格高IDEXX Filta-Max 手动/自动系统 滤器及滤芯FiltaMax Xpress 快速系统-滤器及滤芯过滤器滤芯Filta-Max : 滤芯结构（手动/自动法）v60 层环状海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔)v从60cm 压缩成 3cmv螺栓固定Filta-Max xpress:快速法滤芯结构v40 层海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔)v39层海绵: 40mm x 10mm (18mm中孔)v交互叠放v从7

16、9cm 压缩到 3cmv螺栓固定水样流向1.水样过滤水样从两侧流经压缩的海绵膜汇集至中孔 “两虫”在滤芯表面被捕获滤器连接套件滤器滤芯（过滤模 块） 洗涤管滤芯置于洗涤管,并将 滤芯下部的压缩固定锣 栓解除周律性地压缩/扩展海绵滤 芯2.洗涤(淘洗)滤芯洗涤(淘洗)装置Filta-Max手动淘洗装置Filta-Max自动淘洗装置FiltaMax Xpress 快速淘洗装置过滤器500ml锥 形离心瓶Filta-Max xpress快速法淘洗流程 v滤器（带滤芯）放入淘洗装置v淘洗装置连接缓冲液及空气压缩机v加 4.0 巴(58 psi)压缩空气v按动F1钮v2分钟后收集400ml淘洗液v快速全自动压缩 空气滤器滤芯淘洗液收集1.将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000g离心力下，离心15m