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1、微生物培养基第一节 培养基选择和配制的原则 第二节 工业发酵培养基 第三节 培养基的灭菌第一节 培养基选择和配制的原则n培养基是人工配制的供微生物或动植物细胞生长繁殖和合成 各种代谢产物所需要的、一定比例的多种营养物质的混合物 ，同时培养基也为微生物等提供除营养外的其他生长所必须 的环境条件。n培养基组成对菌体生长繁殖、产物的生物合成、产品的分离 精制乃至产品质量和产量都有重要的影响。n所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需 的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。n大规模发酵生产中还必须重视培养基原料的价格和来源。一一、培养基的类型和用途1. 根据来源分：2. 根据主要成
2、分或使用目的分：3. 根据生产工业的要求分：天然培养基合成培养基半合成培养基基础培养基增殖培养基鉴别培养基选择培养基孢子培养基供制备孢子用；种子培养基满足菌种生长；发酵培养基满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累营养不能太丰富，尤其是有机氮源；无机盐浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色；注意pH和湿度营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高一些除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等二、培养基类型的选择1. 从微生物的特点来选择2. 液体和固体培养基选择3. 从生产实践和科学试验的不同要求选择4. 从经济效益方面考虑选择生产原料三、培养基的配
3、制原则1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基2. 注意速效碳（氮）源和缓效碳（氮）源的配合使用，发挥各自的优势3. 营养成分的恰当配比（C/N一般取100 : 0.22.0）4. 渗透压，营养物质要有合适的浓度5. 合适的pH值（注意生理酸性盐、生理碱性盐和缓冲剂的加入）6. 氧化还原电位7. 考虑营养成分的加入顺序，避免生产沉淀四、培养基成分配比的选择1. 参照前人所使用的较适合于某一类菌种培养基的经验配方 2. 结合所用菌种和产品的特性 3. 采用摇瓶、玻璃瓶等小型发酵设备，对碳、氮、无机盐和前体等 进行逐个单因子试验 4. 观察这些因子对菌体生长和产物合成量的影响 5. 综合考虑
4、各因素的影响 6. 得到一个适合该菌种的培养基配方以得到高产正交试验设计减少试验次数，确定培养基组分和浓度方差分析了解哪些因素影响大，以引起注意四、培养基成分配比的选择a) 氮源过多，菌体繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代谢产物的积累； b) 氮源不足，菌体繁殖量少，影响产量。a. 碳源过多，容易形成较低的pH值； b. 碳源不足，菌体衰老和自溶。C/N不当影响菌体按比例吸收营养物质，直接影响菌体生长和产物形成。注意速效碳、氮源和缓效碳、氮源的相互配合，选用适当的C/N。一般发酵工业中C/N为100:（0.22.0） 但对于氨基酸生产，由于产物中含氮较多，因此C/N就要适当调整 ，如100:（15
5、21）第二节 工业发酵培养基w消耗每克底物将产生最大的菌体得率或产物得率w能产生最高的产品或菌体的浓度w能以最大的速率产生产物w副产品的得率最小w价廉并具有稳定的质量w来源丰富且供应充足w易于通气和搅拌w提取、纯化、废物处理等生产工艺过程都比较容易在发酵工业中，必须使用廉价的原料来配制培养基，使 之尽可能满足下列条件：发发酵培养基例子 代谢产谢产 物 衣康酸赤霉素核黄素青霉素培 养 基甘蔗糖蜜，150g/L ； ZnSO4，1.0g/L； MgSO4，3.0g/L； CuSO4，0.01g/L葡萄糖，20g/L； MgSO4，1.0g/L； NH4NO3，1.0g/L； KH2PO4，5.0g
6、/L； FeSO47H2O，0.01g/L； MnSO44H2O，0.01g/L；ZnSO47H20， 0.01g/L； CuSO45H2O， 0.01g/L ； 玉米浆浆（干固形物）， 7.5g/L大豆油，20mL/L； 甘油，20mL/L； 葡萄糖，20g/L； 玉米浆浆，12mL/L； 酪蛋白，12g/L； KH2PO4，1.0g/L葡萄糖或糖蜜，总总量的10； 玉米浆浆，总总量的45； 苯乙酸，总总量的0.50.8； 猪油或植物油； 消泡剂剂，总总量的0.5一、工业上常用的碳源碳源来源 葡萄糖纯纯葡萄糖，水解淀粉 乳糖纯纯乳糖，乳清粉 淀粉大麦，花生粉，燕麦粉，黑麦粉，大豆粉等 蔗糖甜
7、菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗红红糖，精白糖等在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。甲醇作为底物生产单细胞蛋白（SCP） 用烷烃进行有机酸、维生素等的生产碳源供给菌体生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物。二、工业上常用的氮源无机氮源：氨水，铵盐，硝酸盐等 有机氮源：玉米浆，豆饼粉，花生饼粉，棉籽粉，鱼粉，酵母浸出液等氮源主要构成菌体细胞物质，作为酶的组成成分或维持酶的活性， 调节渗透压、pH、Eh等。工业业上常用的氮源及含氮量（质质量分数/%） 氮源含氮量氮源含氮量 大麦1.52.0花生粉
8、8.0 甜菜糖蜜1.52.0燕麦粉1.52.0 甘蔗糖蜜1.52.0大豆粉8.0 玉米浆浆4.5乳清粉4.5三、无机盐 无机盐是微生物活动不可缺少的物质。 其主要功能是构成菌体成分、作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂、调节培养 渗透压、调节pH值和Eh等。 微生物对无机盐的需要量很少，但无机盐含量对菌体生长和产物的生成影响很大。1. 磷酸盐2. 硫酸镁3. 钾盐4. 微量元素磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。 磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。 工业上常用K3PO43H2O、K3PO4和Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O等磷酸 盐，也可用磷酸。 除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不
9、参与任何细胞物质的合成； 处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧 化酶等）的激活剂； 不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成 钾离子与细胞渗透压和透性有关； 是许多酶的激活剂； 促进糖代谢 Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂； 一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必 另加； 特例：VB12的生产，由于钴是其组成成分，Co的需要量随产物的增加而增加 ，因此在培养基中需加入氯化钴以补充钴四、生长因子从广义来说，凡是微生物不可缺少的微量有机物质，如氨基酸、嘌呤 、嘧啶、维生素等均称为生长因子。 其功能是构成细胞的组成分，促进生命
10、活动的进行。 生长因子不是所有微生物都必需的，它只是对于某些自己不能合成这 些成分的微生物才是必不可少的营养物。目前以糖质原料为碳源的谷氨酸产生菌均为生物素缺陷型，以生物素 为生长因子。提供生长因子的农副产品原料1) 玉米浆2) 麸皮水解液3) 糖蜜4) 酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。五、前体物质和促进剂1. 1. 前体物质某些化合物加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程结合到产 物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但产物的量却因加入而有较 大的提高。 有些氨基酸、核苷酸和抗生素发酵必须添加前体物质才能获得较高的产率 。氨基酸发发酵的前体物质质 氨基酸菌体前体物质质产
11、产量/% 丝丝氨酸嗜甘油棒状杆菌甘氨酸1.6 色氨酸异常汉逊汉逊 酵母氨茴酸0.8 色氨酸麦角菌吲哚吲哚1.3 蛋氨酸脱氢氢极毛杆菌2-羟羟基4-甲基硫代丁 醇1.1异亮氨酸粘质赛质赛 杆菌-氨基丁酸0.8 异亮氨酸阿氏棒状杆菌D-苏苏氨酸1.5 苏苏氨酸谷氨酸小球菌高丝丝氨酸2.0抗生素发发酵常用的前体物质质 抗生素前体物质质抗生素前体物质质 青霉素G苯乙酸或在发发酵中能形成苯 乙酸的物质质，如乙基酰酰胺 等金霉素氯氯化物青霉素O烯烯丙基硫基乙酸溴四环环素溴化物 青霉素V苯氧乙酸红红霉素丙酸、丙醇、丙酸盐盐、 乙酸盐盐 放线线菌素C3肌氨酸灰黄霉素氯氯化物 链链霉素肌醇、精氨酸、甲硫氨酸2.
12、 发酵过程中的促进剂和抑制剂在氨基酸、抗生素和酶制剂发酵工业生产过程中，可以在发酵培养 基中加入某些对发酵起一定促进作用的物质，称为促进剂或抑制剂 。常用促进剂v表面活性剂洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温80、植酸等 v二乙胺四乙酸 v大豆油抽提物 v黄血盐 v甲醇促进剂能促进产量增加的原因： 主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。A. 在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂， 可以大大增加菌体的产酶量。B. 抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。抗生素的抑制剂剂抗生素被抑制的产产物抑制剂剂 链链霉素
13、甘露糖链链霉素甘露聚糖 去甲基链链霉素链链霉素乙硫氨酸 四环环素金霉素溴化物、巯巯基苯并噻唑噻唑 、硫脲嘧啶脲嘧啶 、硫脲脲 去甲基金霉素金霉素磺胺化合物、乙硫氨酸 头孢头孢 菌素C头孢头孢 菌素NL-蛋氨酸 利福霉素B其他利福霉素巴比妥药药物不同促进剂所起的作用：i.起生长因素的作用；ii.可推迟菌体的自溶；iii. 抑制某些合成其他产物的途径而使之向所需产物的途径转化；iv. 降低了生产菌的呼吸，使之有利于抗生素的合成；v.改变发酵液的物理性质，改善通气效果；vi. 可与抗生素形成复盐，降低发酵液中抗生素的浓度和促进抗生素的合成等。第三节 培养基的灭菌n在工业微生物培养过程中，只允许生产菌
14、存在和 生长繁殖，不允许其它微生物共存，因此所有发 酵过程，必须进行纯种培养n整个发酵过程必须牢固树立无菌观念，强调无菌 操作n除了设备应严格按规定保证没有死角，没有构成 染菌可能的因素外，必须对培养基和生产环境进 行严格的灭菌和消毒，防止杂菌和噬菌体的污染n灭菌：利用物理和化学的方法杀灭或除去物料及设备中 一切生命物质的过程。n消毒：用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外 的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽胞 。n消毒不一定能达到灭菌的要求，而灭菌则可达到消毒的 目的。n在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接 种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料 、设备
15、、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒， 防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。n只有不受杂菌污染，发酵过程才能正常进行。一、灭菌的方法干热灭菌法火焰灭菌法电磁波、射线灭菌法湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌）化学药剂灭菌法过滤除菌法l进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内蛋白质变性和电解质浓 缩引起中毒等作用，氧化作用导致微生物死亡是主要依据。 l由于微生物对于热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高， 时间要长，一般160170、11.5h。 l实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。 l利用火焰直接杀死微生物的灭菌法称为火焰灭菌法。该法方法简单，灭菌彻 底
16、，但使用范围有限，仅适用于接种针、玻璃棒、三角瓶口等的灭菌。l利用电磁波、紫外线、X射线、射线或放射性物质产生的高能粒子进行灭 菌，以紫外线最常用。 l紫外线对芽胞和营养细胞都能起作用，但细菌芽胞和霉菌孢子对紫外线的 抵抗力强。 l紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养室等空间的灭菌， 对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。 l250270nm之间杀菌效率高，以波长在260nm左右灭菌效率最高。 l除紫外线外，X射线和射线也可进行灭菌。一、灭菌的方法l利用饱和蒸汽进行灭菌l原理：水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，高压情况下可获得高温的水蒸汽。借助蒸汽的高温和蒸汽释放的潜热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡l从灭菌效果来看，由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热灭菌对耐热芽胞杆菌 来说，温度升高10时，灭菌速度常数可增加810倍，对营养细胞更高。另外蒸汽冷
