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1、 微生物学洪 龙 62756091生物技术楼 微生物学的研究内容参考书（1）微生物学教程（第二版），周德庆， 高等教育出版社，2002 （2） 微生物生物学，杨苏声、周俊初，科 学出版社，2004 （3）“Brocks Biology of Microorganism 11TH” ， Michael T. Madigan， John M. Martinko， Jack Parker，Prentice Hall，2006 （4）“Microbiology”， Lansing M. Prescott, Donald Klein, John Harley，McGraw-Hill Higher Edu
2、cation，2005讲授内容第二章：微生物的纯培养和显微技术 第三章：微生物细胞的结构与功能 第四章：微生物的营养 第七章：病毒(噬菌体) 第十三章：微生物物种的多样性(节选)课件下载：北大教学网微生物学 沈萍主编 2006年 高教出版社第二章 微生物的纯培养与显微技术第二章 微生物的纯培养与显微技术一、显微技术各种显微镜、决定显微镜的分 辨率的因素、细菌的染色方法二、纯培养技术纯培养技术纯培养技术的局限微生物学发展与微生物学技术的关系：列文虎克、巴斯德、科赫微生物学的基础实验技术第二章 微生物的纯培养与显微技术 显微技术 纯种分离与培养技术 无菌技术 染色技术看做第二章 微生物的纯培养与显
3、微技术微生物基础实验课的教学思路第三个模块：四大类微生物的分离；涉及培养四大 类微生物所需培养基的配制，灭菌、纯种分离、保 藏等，巩固第一个模块的知识探索性实验，注重 广度；第四个模块：未名湖水质检测；大肠杆菌的形态、 生理生化、鉴定以及实际应用(国标)探索性实验 ，注重深度；分为4个模块：第一个模块：四大类微生物的形态学特征，基础知 识验证性实验；要求学生能认识四大类微生物；第二个模块：噬菌体效价测定验证性实验；病毒 特性；一、显微技术第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）借助显微镜观察肉眼分辨能力： 0.25mm小微生物的基本特点： 与动物、植物细 胞大小的差异； 一般是单细胞或 简单的多
4、细胞。 微生物生长快速与其大小相关。第二章 微生物的纯培养与显微技术生长速度快与其大小相关比表面积大，有利于营养吸收、物 质交换大肠杆菌代时是20分钟，48小时可产生 2.2*1043个细胞，重量相当于地球的4000倍。我家里的几位女眷想要看醋里 的线虫，可是看了以后，厌恶 地发誓说再也不用醋了。要是 我告诉她们在口腔里牙垢上生 活的动物比全国的人口还多， 她们将会怎样反应呢？Leeuwenhoek微生物的大小第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）细胞型m；非细胞型nm 设计能自主生活的(微)生物 ？科学问题：生命的最小极限？第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 最少的基因数 192，基因敲
5、除与互补 参考文献 Kobayashi K. et al, （2003） Essential Bacillus subtilis genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4678- 4683 256，生物信息学 参考文献 Mushigian, A. R. et al，（1996） A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 93:10268-10273流感嗜血菌 生殖
6、道支原体 理论上最小的可独立生活的生命体应 140nm必需基因的类别第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）物质结构基础水是生命活动重要的、不可或缺的场 所，“勇气”号和“机遇”号的一个重要 使命(1)DNA复制(2)DNA复制的修复系统(3)RNA转录(4)蛋白质翻译(5)分子伴侣(6)能量代谢(7)辅酶(8)细胞膜系统已知最小的独立生活的生命体第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 骑火球纳米古生菌 (Nanoarchaeum equitan) 基因组500kb，直径 400nm 最小的基因组 P379最大的细菌第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）费氏刺骨鱼菌80*600m纳米比亚硫珍珠菌
7、750m决定显微镜观察效果的因素第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 分辨率：最小可分辨距离 反差：样品区别于背景的程度波长振幅显微镜的种类第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 电子显微镜 透射电子显微镜扫描电子显微镜扫描隧道显微镜 光学显微镜 普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜分辨率是决定观察效果最重要的指标第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）0.5 l 分辨率= n sin n玻片与物镜间介质的 折射率 空气 (n=1.0)； 水 (n=1.33)； 香柏油 (n=1.52)； 玻璃 ( n=1.54)光学显微镜原理第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） :物镜镜口角的一
8、半 n sin ：数值孔径（numerical aperture） 其数值越大，显微镜分辨率越好。光学显微镜原理第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）光线在穿过折射率不同的 介质时发生折射观察细菌应使用油镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 浸没油与玻璃的折射率相近 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和 折射而损失的光线可以进入物镜，使照明 亮度提高，改善观察效果。第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）放大倍数越高，工作距离越短光学显微镜物镜的特性第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）在对细菌、放线菌等进行光学显微镜观 察时，油镜最常使用，也最为重要。提高数值孔径的途径第二章 微生物的纯培
9、养与显微技术（一） 增大透镜直径，以增加镜口角；不实用 增加折射率； 采用短波长的电磁波暗视野显微镜 （dark-field microscopy）第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）样品与背景之间的反差增大第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）样品与背景之间的信噪比增大暗视野显微镜 （dark-field microscopy）暗视野显微镜 （dark-field microscopy）第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 小至 4200nm的微粒子，分辨率可比 普通显微镜高50倍 生物体的明细外貌及其运动，但是看不 见内部细微结构。 相差显微镜(phase-contrast micro
10、scopy)第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）荷兰人Frits Zernike (F泽 尔尼克)1953年，诺贝尔物理学奖相差显微镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）原理：细胞各部分的折射率及厚度差 异 光程差 相位差 相板 振幅差(明暗差)细胞内 部结构荧光显微镜 ( Fluorescent microscopy)第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）荧光显微镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）荧光显微技术 在免疫学、环 境微生物学、 分子生物学中 应用普遍。各种光学显微镜的使用范围第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 暗视野显微镜：未经染色的活细胞 ，背景暗，标本亮，样品的轮
11、廓、运动 普通光学显微镜：经染色的细胞 ，背景亮，标本暗 荧光显微镜：观察特异的细胞 相差显微镜：细胞内的细微结构STORM（stochastic optical reconsctruc -tion microscopy，随机光学重建显微镜） 荧光成像技术 突破光学衍射极限超高分辨率电子显微镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）光学显微镜 ( = 550 nm) 的分辨 率为 220 nm。电子的波长比可见 光小1000倍。透射电镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 使用电 子，电 磁圈和 荧光屏第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）分辨率：0.2nm(理论值)透射电镜：细胞内的超微结构
12、 超薄切片 镜筒高度真空透射电镜扫描电镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 经磁透镜 汇集的电子 探针在样品 表面扫描， 激发出样品 释放出二次 电子，根据 二次电子的 多少可获得 样品表面的 立体形貌。 分辨率为 10nm。样品的表面扫描电镜扫描电镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 样品的表面扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(STM)(STM)第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）横向分辨率可以达到0.1-0.2 nm，纵 向分辨率可以达到0.001 nm，是目 前分辨率最高的显微镜。 样品的样品的表面有一表面有一 定的导电性定的导电性； 样品的样品的表面表面； 样品不受破坏。 原子力
13、显微镜原子力显微镜第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 利用激光装 置来检测探针 和样品之间的 相互作用； 适合生物 材料。光学显微镜观察样品的制备和染色光学显微镜观察样品的制备和染色第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 直接观察活体：可以避免染色固定时对微 生物结构的破坏，主要用来观察微生物的大致 形态和运动情况压滴法悬滴法压(埋)片法微生物细胞一般透明 染色压滴法(水封片法)示意图第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）悬滴法示意图第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）埋片法示意图埋片法示意图第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）染色观察染色观察第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 微
14、生物无色透明，与背景折光率 相差无几，染色可增强反差 染色前需固定显微镜下观察到细菌的大小受固定方 法影响固定的目的第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 杀死细菌并使菌体粘附在玻片上 增加染料对细菌的亲和力固定的方法第二章 微生物的纯培养与显微技术（一）使蛋白质变性 加热 化学试剂：乙醇、醋酸、甲 醛、戊二醛 保持细胞原来的形态，防止变形细菌染色法第二章 微生物的纯培养与显微技术（一） 活菌活菌：美兰等染料低毒性；能区分死活细胞正染色：菌体着色，背景无色； 负染色则反之。 死菌死菌：正染色简单染色：一种染料鉴别染色 ：两种染料不同颜色的染 料，如革兰氏染色、芽孢染色、抗酸性染色等负染色 荚膜
15、染色二、微生物的纯培养技术二、微生物的纯培养技术第二章 微生物的纯培养与显微技术（二）1、纯种分离技术高密度培养纯种培养的局限2、纯种培养微生物的基本特点第二章 微生物的纯培养与显微技术（二）小小培养技术培养技术在微生物在微生物 学中具有重要意义！学中具有重要意义！ 在绝大多数情况下都是利用微生物的群 体来研究其属性； 微生物的物种(菌株)一般也是以群体的 形式进行繁衍、保存；第二章 微生物的纯培养与显微技术（二）在研究中使用微生物培养群体培养物：在一定的条件下培养、繁殖得 到的微生物群体混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：只有一种微生物的培养物；纯培养技术是进行微生物学研 究的基础！第二章 微生物的纯培养与显微技术（二）高密度培养 又称高密度发酵，一般要求大肠杆菌 培养液浓度达到50g/L干重，应用于大 规模制备重组蛋白。 外源基因表达产量与细胞浓度正相关 。柯赫法则不适合专性寄生的病原菌第二章 微生物的纯培养与显微技术（二）纯培养的局限二元培养物、不可培 养与混合培养二元培养物：培养物 中只含有两种微生物 ，并有意识地保持两 者之间的特定关系。病毒：因无法获得绝 对意义上的纯培养， 以二元培养物来作为 纯培养的替代。第二章 微生物的纯培养与显微技术（二）不可培养与混合培养不可培养微生物 (uncultur
