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1、生化测量系统的校准南通大学附属医院 王惠民一、与校准相关的一些基本问题 校准（Calibration）重要吗？ 实验室中测量不合格约15%由校准误差所致 临床医生往往认为检验结果的“不准”是由不正确 的校准造成的 陈文祥主任认为，检验结果互认的前提是：测量结果是否具有可比性（溯源，方法性能评价：校准）可比性的标准参考测量区间（一致化问题） 校准受到重视了吗？ 一般由组长进行校准 一般无SOP，或SOP不够详细 CLSI或去其他的国际组织尚未有相应的标准或指南 一般的实验室无校准的记录 科主任一般不过问校准的正确与否 校准什么？ 测量仪器？测量系统（“调标”或“定标”）？ 测量仪器：单独或与辅助
2、设备组合，用于测量的装 置。 测量系统：由一台或多台测量仪器所组成的用于特 定测量的成套系统，包括试剂和电源等。 校准实际上就是将测量系统与“参考系统”进行比 较，并将测量系统调整至参考系统相一致水平的过 程。 实际上，有些情况下不需要对测量系统进行校 准 临床化学测量常根据系数进行计算例：酶催化活性浓度的测量F值又称为K 值项目理论 K值校准K值校准K值与理论K值之间的误差 RANDOX 试剂国产试剂RANDOX 试剂国产试剂ALT-3633-4201-5079-15.63%-39.80%AST-3633-4211-5020-15.91%-38.18%ALP326239664090-21.5
3、8%-25.38%GGT496450595286-1.91%-6.49%CK 71066236573412.24%19.31%LDH71061025413785-44.30%-93.99%校准K值与理论K值的比较 DiaSys Randox 为什么用校准品后得到的K值与理论K值不 一致？ 校准品是如何定值的？方法不一样（参考方法）仪器不一样（最好的仪器，每次定值前都必须对仪器进行校准）试剂不一样（最好的试剂）参考方法与常规方法测量仪器的差异参考方法 （Agilent Cary 4000 ）常规方法 （JJG464-2005 要求 ） 波长准确度 0.1nm5nm波长精密度 0.025nm2.5
4、nm吸光度准确度0.00025A0.07A温度准确度370.137.00.1半波宽0.05nm15nm二、校准前的准备1.生化分析仪的准备 生化分析仪的校准或检定 生化分析仪的性能验证2.试剂的准备 试剂是否获准入 试剂的性能验证3.水的准备1.生化分析仪的准备 生化分析仪的校准或检定由厂家根据其标准对生化分析仪进行校准由有关计量部门根据国家标准（JJG494-2005）对仪器进行检定生化分析仪的性能验证（根据中华人民共和国生化分析 仪检定规程JJG 494-2005进行） 零点漂移 波长准正确度及重复性 杂散光 吸光度正确度 吸光度重复性 吸光度线性误差 交叉污染率 温度正确度 比色杯间差距
5、生化分析仪检定用标准物质 用于吸光度正确度与重复性检定的标 准物质 杂散光检定的标准物质 吸光度线性检定的标准物质 交叉污染检定的标准物质中国计量科学研究院，北京市北三环东路18号 ，电话：010-64524710，64278838零点漂移开机30min, 用蒸馏水调吸光度至0.000处 ，10min内吸光度的最大变化值应符合下表 规定：类 级 飘移值一 （棱镜式或 光栅式）A0.002B0.004C0.006二 （干涉滤光片或 吸收滤光片）A0.002B0.004C0.006单波长(nm)飘移（A）双波长(nm)飘移（A）3400.0148340/4050.00154050.0093405/
6、5700.0009450-0.0060450/6000.00045050.0088505/6600.00066600.0036660/750-0.0004复兴仪器的零点飘移复兴仪器340nm零点漂移复兴仪器340nm零点漂移复兴仪器405nm零点漂移复兴仪器405nm零点漂移复兴仪器340/405nm零点漂移复兴仪器340/405nm零点漂移复兴仪器405/505nm零点漂移出现零点飘移可能原因 电压不稳 光电倍增管或光接收元件老化 仪器灵敏度过高 仪器设计与制造的缺陷波长的正确度波长正确度的测定方法根据分光原理不同而异 分光式仪器（光栅由于不需传动调节波长，一般 不需校准）低压汞灯、氘灯、干
7、涉滤光片 镨钕滤光片、氧化钬滤光片 滤光式仪器 将滤光片拆下在已校准的分光光度 计上进行波长扫描，测定波长和半波宽一般仪器不容易拆卸特征谱线 低压汞灯: 253.7nm 氘灯: 486nm、656.1nm 镨钕滤光片: 529nm、808nm（400nm900nm内至少 有10个吸收峰） 氧化钬滤光片: 200700nm共12条谱线 干涉滤光片: 长波通滤光片: 2001100nm，光学分辨率为 1nm短波通滤光片: 400700nm，光学分辨率为1nm波长的重复性指多次波长测试数据的离散性，或者多次波长测试数据的符合程度。 一般取波长正确度的3次测试结果中最大值与最小值之差作为波长重复性。波
8、长正确度及重复性的要求 （nm）类级波长范围正确度重复性 一（分光 类仪器）A34070010.5 B34070031.5 C34070052.5类级波长范围正确度半波宽 二（滤光 类仪器）A340700210 B340700412 C340700615杂散光杂散光与波长的半波宽有关，半波宽越大，杂散光越多。测定50g/L亚硝酸钠（NaNO2）标准溶液相对于蒸馏水在340nm处的吸光度，了解杂散光的多少。亚硝酸钠溶液的配制方法将分析纯亚硝酸钠固体试剂放入称量瓶置于烘箱中，在箱温为 1055下烘2h，取出置于干燥器中冷却至室温，在分析天平上（ 精度为0.1mg）精确称取10g，置于200mL烧杯
9、中，用小半杯蒸馏 水溶解后移入200mL容量瓶中，以少量蒸馏水冲洗烧杯三次，均倒 入容量瓶中，然后用蒸馏水稀释至刻度线反复摇匀，置于阴凉干燥 处备用。340nm340nm340nm345nm345nm杂散光1）在波长340nm，第一个试剂位放入蒸馏水，以蒸馏水为样本，重复测定5次吸光度值；第二个试剂位放入NaNO2溶液，以NaNO2溶液为样本，重复测定5次吸光度值；或将蒸馏水和NaNO2溶液分别加入同一比色杯读取吸光度（可消除比色杯误差），重复测定5次，共得5个蒸馏水和5个NaNO2溶液的吸光度。2）最小NaNO2溶液吸光度-最大蒸馏水吸光度2.3。复兴仪器的杂散光测定复兴仪器的杂散光测定复兴
10、仪器的杂散光测定（空白）吸光度正确度指吸光度实际测定值与理论值之差，该偏差越小吸光度正确度越高，间接说明波长的正确度与杂散光的多少。1）国家标准物质法2）己糖激酶法吸光度正确度1）国家标准物质法：使用国家标准物质研究中心制备的标准物质溶液，其吸光度分别为0.5和1.0。在340nm波长、比色杯光径1cm时，以标准物质标示的参比液作参比，测吸光度值，重复测 量3次。计算3次测量值的算术平均值与标准值之差，0.5的标准液允许误差为0.025， 1.0 的标准 液，允许误差为0.07。测定结果 标准物质的吸光度：A1-1=0.489 A1-2=0.980 （不 确定度：0.005） 检测结果：A1-
11、1=0.4916；0.4836；0.4812，均值为0.4855A1-2=0.9703；0.9714；0.9722，均值为0.9713 结果判定：A1-1误差0.025；A1-2误差0.07。即0.464A1-10.514；0.910A1-21.050吸光度正确度2）己糖激酶法用己糖激酶（HK）法测定葡萄糖浓度时，反应产生 NADH，在340nm 测定吸光度，间接测NADH的（理论 值为6220），以此为标准校正。以HK测葡萄糖为例，试剂反应过程如下： HK葡萄糖+ ATP-6-P-葡萄糖+ ADP, G6PDH6-P-葡萄糖+ NAD+-葡萄糖酸+NADH, 影响吸光度准确度的主要因素 杂散
12、光多 波长不正确 标准液不正确 仪器的灵敏度或其他原因吸光度重复性1）以重铬酸钾标准溶液为样本，在波长340nm，吸光度为0.30.5,以蒸馏水为空白,试剂量为全自动生化分析仪标称的最小试剂量、测定时间为10min；每30秒读取吸光度,连续20次，得到20个吸光度值。计算CV，应1.0% 2）采用吸光度约为0.5生化分析仪用吸光度标准物质，在340nm处连续测定5次，然后计算其中最大值与最小值之差。吸光度的重复性均应不大于0.005 检测结果： A1-1=0.4828；0.4831；0.4836；0.4812；0.482 0.4836-0.4812=0.00240.005吸光度线性误差分别用浓
13、度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/L的氯化钴标准溶液，以蒸馏水为对照，在510nm（500-520nm）测定各溶液吸光度，连续测量3次，然后将所得数据求相关系数，r0.995。或按下列公式计算，线性误差符合规定要求。分光装置吸光度范围线性误差（% ） 棱镜或光栅0.1-0.35 0.3-0.64 0.6-0.95 结论：符合吸光度线性要求交叉污染率概念：由测量系统将一个检测样品反应携带到另一个检测样品反应的分析物不连续量，由此错误地影响了另一个检测样品的表现量。1、氯化钴方法2、桔红G方法3、临床标本的检测：50U/L与250U/L的AST或ALT测定测定方法：将氯化钴标准溶液按
14、仪器规定的最小样品量，先用质量浓度为2.0g/L的氯化钴标准溶液将比色杯冲洗三次，接着对该溶液连续测量四次。按上述方法依次循环对2.0和10.0g/L氯化钴标准溶液重复测得七组在510nm处的测量值（四组低浓度值和三组高浓度值），然后按以下公式将每相邻两组值进行计算，得到三个低浓度到高浓度的计算值和三个高浓度到低浓度的计算值，即为交叉污染率，均应1.5%。 L1=0.1634；L2=0.1691；L3=0.1639；L4=0.1668 H1=0.8316；H2=0.8331；H3=0.8305 CoLH=(0.8317-0.8316)/(0.8317-0.1666)100%=0% CoHL=(
15、0.1634-0.1666)/(0.8317-0.1666)100%=-0.4% 结论：交叉污染率符合要求 温度正确度 用分度值小于0.1专用测温装置，测定比色 杯的设定温度，当仪器升到设定温度范围内 ，每隔30s记录一次温度，连续测10次，计算 平均值。Fluke 1521点温度计（0.001C）。类类级级温度准确度一、二A 0.1B0.3C0.5137.18 2 0.182 937.07 9 0.079 2137.06 9 0.069 2937.11 2 0.112 4137.06 9 0.069 4937.03 5 0.035 6136.99 3 - 0.007 6937.02 8 0.
16、028 8137.02 0 0.020 8937.069 0.069 10137.088 0.088 11937.053 0.053 12137.095 0.095 12937.125 0.125 14136.977 -0.023 14937.062 0.062 15136.811 -0.089 15937.045 0.045 杯号温度温度差杯号 温度温度差极差0.205 比色杯间差距以重铬酸钾标准溶液为样本，在波长340nm，吸光度为0.30.5,以蒸馏水为空白,每比色杯重复测定3次，平均吸光度值应小于0.05（Olympus)。杯号A杯号A杯号A杯号A10.403110.4011210.4016310.404320.4018120.4047220.4093
