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1、激光扫描共聚焦显微镜原理 及应用来滨复旦大学上海医学院医学神经生物学国家重点实验室显微镜各种染色 标记技术荧光标记技术优点：1.灵敏度高，比常规免疫组织化学的灵敏度高1000倍。2.通过不同颜色荧光标记可以清楚的观察多种物质的共定位。3.可以观察活细胞中离子或蛋白的动态变化荧光显微镜 激光共聚扫描焦显微镜 双光子激光扫描显微镜荧光发生的原理荧光和荧光显微镜 一、荧光的基础术语荧光物质：某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION)：能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素
2、的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长)488nm 520nm异硫氰酸荧光素(FITC)发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长) 荧光探针：能产生荧光的特异性生物染料、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体） 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理 漂白(BLEACH)：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 漂白。二、荧光显微镜术的基本原理荧光显微镜激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490长、短通
3、滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490紫外 蓝 绿高 压 汞 灯被荧光 探针染 色的生 物样本激发被标记 结构的 荧光光 学图像光学 成像滤镜 分光488nm 520nmFITC450nm 490nm普通荧光显微镜是广视场显微镜普通荧光显微镜是广视场显微镜荧光相互干扰图象清晰度降低激发的特异性差背景荧光高蓝光 (激发滤色片 420-485 nm) 绿光 (激发滤色片 460-550 nm) 紫外光 (激发滤色片 330-400 nm) 高压汞灯：什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？共聚焦激光扫描荧光显
4、微镜（Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope；LSFM） 以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭 聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统共聚焦系统 细胞CT 共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置Laser and electronic Control Unit 激光光源及 控制装置Computer 计算机Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置Microscope 荧光显微镜Anti- vibration table 防震台 Leica TCS SP-2 MP
5、 AOBS Confocal System不同波长的激光光源如：340nm、488nm、543nm等点照明共轭聚焦扫描装置数字化图像合成激光扫描共聚焦显微镜与普通荧光显微镜的主要区别光电倍增管检测针孔光源针孔光源分色镜物镜样本聚集平面激光扫描共聚焦显微镜光学原理荧光显微镜confocal检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点(共轭聚焦)，使聚 焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔 高分辨率 的光学切片激光穿透性强，可对样本进行一定深度光学断层，获 得高标准的连续光学切片 实现三维重建激光扫描共聚焦显微镜应用领域只要目的结构是用荧光探针标记的，都可 用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察。形态学研究：细胞
6、凋亡、中枢神经系的F联 系、肿瘤细胞分类分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量， DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变 、受体与配体相互作用活细胞动态荧光测量：细胞内Ca+、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 细胞连接间的信息沟通直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白基本应用1.定位、定量 三维重组 动态测量活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化测量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+)自由基的检测药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 蛋白质的转位活细胞内H+浓度（ pH值）的测量线
7、粒体膜电位的测量 4.荧光漂白恢复（FRAP）技术 6.荧光能量共振转移（FRET）技术1. 定位荧光串色根据荧光染料的性质可将荧光串色分为二类：第一 类串色是：两个荧光染料的激发光谱没有重迭 ，但发射光谱有重叠。因为两种荧光染料的激 发光谱不重迭，所以可以使用序列扫描的方法 来排除串色的影响：即先使用第一种荧光染料 的激发光扫描一张图像，再使用第二种荧光染 料的激发光扫描第二张图像。 第二种串色是：两个荧光染料的发射光谱和吸收光 谱都有重迭。使用光谱扫描的方法可以排除这 类串色的影响。在后面会详细介绍光谱扫描方 法。荧光串色是指两种或多种荧光染料的发射 光谱互相重迭的现象：当使用多种荧光染
8、料标记标本时，或当标本具有很强的自发 荧光时，很容易产生串色现象。1. 最简单的用来确定有无荧光串色的方法是使用单荧光标记的标本作 对照：首先观察第一种荧光染料单标记的标本，使用第一种荧光染料的激发 光，在第二种荧光染料的探测通道上观察有无荧光串色；然后观察第 二种荧光染料单标记的另一个标本，使用第二种荧光染料的激发光， 在第一种染料的探测通道上观察有无荧光串色。如果发现有荧光串色，则根据不同情况，使用序列扫描或光谱 扫描的方法来排除串色的影响。1. 最简单的用来确定有无自发荧光的方法是使用与观察标记标本相同的 仪器参数去观察一个未经染色的对照标本。 2. 为了尽量排除荧光串色的影响，在实验中
9、应注意以下几点： 尽量选择发射光谱较少重迭的荧光染料； 尽量选择吸收光谱较少重迭的荧光染料； 使用只能激发一种染料的激光线来扫描标本，并采用序列扫描的方法； 确保每种荧光染料的标记强度是一致的，即：不要将一种颜色标的太强或 太弱； 确保荧光信号比自发荧光要强；序列扫描的方法排除荧光串色如图所示是使用序列扫描的方法排 除荧光串色的例子： 使用 DAPI （蓝色）来标记细 胞核、Cy2 （绿色）来标 记 Na+/K+ ATPase、 Alexa 568 phallodin （红 色）来标记 F-actin。 未使用序列扫描的时，DAPI 的信号串到了 Cy2 通道， Cy2 的信号又串到了 Ale
10、xa 569 通道。 同一个标本使用序列扫描后， 所有的颜色都被清楚的分 开，排除了荧光串色的影 响。Z轴定位 xyzy动态观察蛋白转运 首先是染料的存在形式： a)根据荧光染料的存在形式可以分为盐、甲基乙 酸酯、和右旋糖酐等。 b)荧光染料的存在形式影响染料的装载方式、染 料在细胞内的分布、以及染料在细胞内的保持 。 c)盐和右旋糖酐形式的染料一般采取微电极注射 的装载方式。以酯形式存在的染料可采用孵育 的方法，使染料按浓度梯度被动的装载到细胞 内，并被细胞内的酯酶剪切成细胞膜不通透的 产物。活细胞内离子动态变化测量原理: 检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞
11、膜，只有与乙 酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内, 被细胞内酯酶水解后方能与胞内游离钙结合后发出荧光 。活细胞内离子动态变化测量细胞内游离Ca2+测量荧光探针 激发波长 发射波长Calcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMOregon Green 488 494nm 520nm 20,000nMFLuo3-AM, 464nm 526nm 390nMKCL诱导的细胞外Ca2+内流测量培养/分离的细胞 20M Fluo 3-AM负载液30-60min 清洗、换液 扫描KCL若须快速测量1.改变扫描速度 2.采用双
12、向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率） 4.采用线扫描(xt)KCLIntensityBefore bleach After bleach 90 min after bleach4. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递光漂白技术的基本原理是：使用强激光照射，将细胞内的一 个区域内的荧光分子漂白，然后观察未漂白的荧光分子的 运动。 GFP 是比较适合用于光漂白研究的荧光分子。 a) 首先，它比较亮、稳定、在活细胞内没有毒性， 在使用低激光强度拍摄图像时漂白较少。 b) 其次，在使用高强度激
13、光照射时，GFP的光漂白 是非可逆的，并且 GFP 的光漂白不会造成细胞 损伤。 分子融合技术将绿色荧光蛋白和特定蛋白分子融合， 使得光漂白技术可以用于研究蛋白分子在细胞内的运 动。激发方式：单光子激发观察方式：以荧光为主光源：激光（紫外、可见光、近红外）照明方式：点照明、逐点扫描成像方式：共轭聚焦、逐点成像输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析激光共聚焦扫描显微镜的基本特点Leica TCS SP2双光子激光共聚焦扫描显微镜激光波长：780920nm；458nm、476nm、488nm、 514nm、543nm、633nm 显微镜：倒置显微镜适用标本：培养细胞、固定组织切片谢谢大家！谢谢大家！
