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1、碱变性法小量提取质粒 DNA的限制性酶切厦门大学医学院分子生物学实验教学组目的 掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法:最常用的提取基因工程中运载基因的载体 掌握质粒酶切鉴定原理, 学会根据目的基因和实验目的选择合适载体与限制性内切酶，设计构建体外重组分子 质粒(plasmid)是染色体外能够进行自主复 制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和 细菌细胞中染色体以外的DNA分子，在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。质粒DNA的提取方法 方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析 法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理 所有分离质粒DNA
2、的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求碱裂解法基本原理：1. 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来2.在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子 筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质 量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的 迁移速度与相对分子质量
3、的对数值成反比关系。因 此，凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA分子：其中超螺旋结构泳动最快，其次为线性 结构，最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两 个质粒连在一起），而不是开环结构（用EcoRI来 线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质 粒DNA的位置与这三条带的位置不一样）3. 溴化乙锭是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光 原理示意图 限制性核酸内切酶: 一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解 酶。 限制性切酶以内切的方式水解核酸链
4、中的磷酸二 酯键，产生的DNA片段5端带磷酸基团，3端 为-OH。限制性核酸内切酶分类 识别切割特性 催化条件 是否具有修饰酶活性 至2005年1月，共发现限制酶3681种 型59种 型3612种 型10种 商业化的限制酶有 588 种，在 型限制 酶中共有 221 种特异性。型限制与修饰系统 占90%以上，即通常指的DNA限制性内切酶，它们 能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的DNA片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助 因子，识别顺序一般为4-6个碱基对的反转重复顺 序； 型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口：5 端突出，3端突出和平末端。
5、酶切反应中应注意以下几个问题： 1. 内切酶：不应混有其他杂蛋白特别是其他内切酶 或外切酶的污染；注意内切酶的识别位点和形 成的粘性末端； 2. 内切酶的用量：根据内切酶的单位和DNA用量而 定。使用中一般以1 g DNA用2-3U酶进行酶切 为宜； 3. 内切酶体积：不能超过反应体系的10%，因内切 酶中含50%甘油，体系中甘油超过5%会抑制内切 酶的活力； 4. 操作条件：应在低温下进行（冰上）；使用时防 止操作中对内切酶的污染。5. DNA：作为内切酶的底物，DNA应该具备 一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、 乙醚、SDS和酒精等，这些因素的存在均 在不同程度影响限制性内切酶的活性。
6、反应缓冲液：1. 反应缓冲液: 主要由Tris-HCl、NaCl、Mg2+ 组成，其中Mg2+ 为内切酶的辅基； A. Tris-HCl维持反应体系的PH值在7.27.6之 间； B. NaCl浓度：低盐(10mM NaCl)中盐(50mM NaCl)高盐(100mM NaCl)2. 酶解的温度：大多数限制酶的反应时间为37 ，如EcoR、Hind、BamH、Pst等，也 有如Bcl需在50下进行反应。 3. 酶解反应时间：根据酶的单位与DNA用量之比 来定，原则是酶/DNA23，12小时即可充分 酶解。 4. 酶单位定义：在每种内切酶理想的反应条件下 ， 0.05mL反应混合物中, 1小时消
7、化1g底物 DNA的酶量为1单位(1U)。三 质粒提取实验材料与试剂 （一）实验材料： 过夜培养大肠杆菌DH-5a （二）实验试剂： LB培养基 0.1M NaCL、10mM Tris.CL（pH8.0）、 1mM EDTA、 Amp 50mg/ml、酚、氯仿、Rnase、琼脂糖 TE：10mM Tris.CL （pH8.0），1mM EDTA 溶菌酶 10mg/ml（用10mM Tris.CL，pH8.0，新鲜配 制） 溶液溶菌液： 50mM 葡萄糖，25mM Tris.Cl（pH8.0），10mM EDTA ，2mg/ml 溶菌酶。 溶液 NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1% SD
8、S。 溶液 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。四步骤(一) 细菌培养与质粒扩增1. 挑单克隆E.coli菌株接种到4ml LB培养液中（ 含Amp 50g/ml），37 225rpm振荡培养过夜。（活化菌种）2.从中取2ml种子菌液于含Amp培养基500ml中， 37振荡培养3-4小时（OD6001.0） 3.取4ml培养液至Eppendorf管中，12000 rpm，4 离心30秒，弃上清，用1ml STE悬浮菌体，再离 心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀。步骤二 质粒提取1. 取4ml培养物至Eppendorf管中
9、，12000rpm，4 ，离心30sec，弃上清。 2. 用1ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复 一次，弃上清取沉淀，使细胞沉淀尽可能干燥 。 3. 将细菌沉淀悬浮于100l预冷的溶液I中，加入 10 l溶菌酶（10mg/ml），剧烈振荡均匀，冰 上放置1分钟。 4. 加200L溶液II（新鲜配制），盖紧Eppendorf 管，快速轻柔颠倒5次，混匀内容物，将 Eppendorf管放在冰上3分钟 。5.加入150L溶液III （冰上预冷），盖紧管口，颠 倒数次使混匀，冰上放置5min。 6.12000r/min， 4 离心5min，将上清夜转至另一 1.5ml Eppendorf管中
10、。 7.加入等体积酚/氯仿（1：1），振荡混匀，室温放 置5-10min，12000 rpm，4 下离心2分钟，倒去上清，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加入2倍体积冰预冷无水乙醇，振荡混匀，12000 rpm 4 离心5分钟。 9. 倒去上清，加入1ml冰预冷70%乙醇振荡漂洗 DNA沉淀。12000 rpm，4 离心2分钟。 10弃上清并尽量吸除液体，打开管盖，室温放 置5min。室温放置15min干燥。 1150L TE缓冲液（含无DNase的RNase 20 g/ml） ，使DNA完全溶解（-20保存） 12取样品10 l加2ul 6 Loading buffer
11、于1 %琼脂糖电泳，电泳凝胶在凝胶成像系统上成像。双酶切实验材料 限制性内切酶：EcoR、Xba和Hind DNA：DNA和质粒pCDNA-p38 10buffer H （37, PH7.5）90mM TrisCl50mM NaCl10M MgCl2 10buffer M（37, PH7.5）6mM TrisCl100mM NaCl6M MgCl2 1mM DTT 10BSA： 1mg/ml 无菌水方法和步骤1. 反应体系配制： 质粒pCDNA3p38 10 l（1g）10buffer M 2 l10BSA 2 lEcoR 1 lXba 1 lH2O 4 l总体积 20 l2. 将反应体系充分
12、混匀，并于台式离心机上短暂离 心收集液体。 3. Eppendorf管于37水浴中反应23小时。 4. 反应结束后70灭活15min或者加入EDTA至终浓 度10mM终止反应。 5. 取20l反应液加入6loading buffer混匀于1.2 琼脂糖凝胶胶上150伏电泳，约30min 加入5l 未酶切对照。 6. 凝胶成像体系观察记录结果。 7.当DNA条带充分分开后，在紫外灯下细心切取所要 的DNA条带。尽量去除多余的凝胶。紫外灯照射 DNA片段不要超过30秒。注意保护眼睛免受紫外线 伤害。五 实验结果 双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释 倍数50/1000。 RNA样品
13、浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数 40/1000。 （在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相当于双 链DNA浓度为50g/ml；单链DNA为37 g/ml； RNA为40 g /ml。）凝胶成像结果1.2% Agarose Gel1 2 3 41.1000bp DNA ladder 2. CDNA3-p38/EcoRI+XbaI 3. ppCDNA3-p38 4.100bp DNA ladder六注意事项 为提高质粒产量，要注意下面步骤： 加入溶液I 后，涡旋振荡应充分打散菌体使之均匀悬浮； 加溶液II裂解要完全(快速轻柔颠倒5-10次) ，使蛋白质和核酸变性； 加溶液III
14、后PH要达到中性(轻柔振荡5-10次 )，使质粒DNA复性，这样才能使质粒DNA与染色体DNA完全分开，否则，难分开，所以裂解和复性这两步要从严掌握。 加入乙醇沉淀DNA时，要把离心管盖上盖子倒翻摇动几次，注意观察水相和乙醇之间没有分层现象之后，才可以放到冰箱中去沉淀DNA。 七思考题1.要得到高质量质粒样品，用碱变性法小量提取质 粒时要注意什么事项？ 2.溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？在实验 中分别加入上述溶液后反应体系出现的现象及其 成因是什么？ 3.酚氯仿抽提时DNA溶液体系出现什么现象？为什么 ？ 4.沉淀DNA时为什么要用无水乙醇及在高盐、低温条 件下进行？5. 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？6. 如何选择DNA和限制性内切酶的用量？7. 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个 反应体系的10%？注意 EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去
