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1、FLOW CYTOMETRY流式细胞技术流式细胞术流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式细胞 仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学 颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。原理：以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的 强度，从而对细胞(微粒)的性状进行定性、定量分析和分选。流式细胞仪简介流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点单细胞悬液单细胞悬液 或生物颗粒
2、或生物颗粒分析速度高分析速度高多参数多参数精度高精度高当代最先进的细当代最先进的细 胞定量分析技术胞定量分析技术流式细胞仪的分类n分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。n分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，需要保持无菌状态，所以分选型流 式细胞仪一般只用于分选，不兼单纯分析。BD公司产品FACS Calibur特点：特点： 光路调节系统固定光路调节系统固定 自动化程度高自动化程度高 操作简便操作简便 使用寿命长使用寿命长 配备配备1-21-2根激光根激光 细胞分选速度慢，细胞分选速度慢，主要用于细胞分析主要用于细胞分析台式机台式机双激
3、光四色，市场覆盖率最高FACSAria 科研型分选流式细胞仪特点：特点： 分辨率高分辨率高 选配多种波长和选配多种波长和 类型激光器类型激光器 可将感兴趣细胞可将感兴趣细胞 分选到特定培养孔分选到特定培养孔 或板上（或板上（4 4路和路和2424 孔板）孔板） 适用于高速分选适用于高速分选 和多色分析和多色分析FACS Vantage DiVa科研型（大型机）特点： 多数字化 适用用各类细胞分选 4路分选Beckman Coulter流式细胞仪Epics XL 单激光四色， 市场覆盖率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC 500 单激光或双激光五色 ，市场覆盖率高，分析型Gallios 三
4、激光十色， 分析型MoFlo XDP 高端分选型第一节 流式细胞仪结构组成n液流系统n光学系统n电子数据系统n细胞分选系统液流系统液流系统n鞘流技术：根据层流原理发 展起来的技术，可以实现两 种液体的同轴流动，样本细 胞流位于轴心稳定流动，外 面包裹有鞘液(sheath)。n流体动力学聚焦：稳定的液 流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后，有一 个聚焦收缩作用，细胞流直 径被约束在10-20um，避免 了多个细胞重叠进入检测区 。鞘液鞘液细胞流激光照射点流体动力学聚焦示意图液流驱动系统进样速率控制 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的
5、距离 。 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。光学系统激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。光学原理散射信号与荧光信号荧光信号物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态 ，再回到低能状态时释放出的光。发射波长(荧光波长) Emission wavelength激发波长 Excitation wavelengthLongpass Shortpass Bandpass460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50光收集系统：滤光片电子
6、数据系统电子数据系统构成：n光电检测器 将光信号转换成电子信号。n前置放大电路 将信号等比例放大，输出电脉冲信号。n模数转换器 将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。n数据处理系统 计算机系统数据采集、分析。光电检测器(photodetector)n光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；n光电倍增管(photomultiplier, PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC, FL1, FL2, FL3, FL4)。PMT前向散射光 光电二极管光信号的类型：n散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。 前向散射光(forward scatter, FSC); 侧向
7、散射光(side scatter, SSC).n荧光信号 自发荧光 ：微弱 特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。流式细胞分析的信息光信号检测流式细胞的基本信息: “形态”散射光的作用n实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同 的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片流式细胞的主要信息:FluorescencenFL1nFL2nFL3nFL4最常用的标记方法是荧光素分子标记 的抗体与细胞抗原结合nForward scatter (FSC)nSide scatter (SSC)nFL1-绿绿色nFL2-黄色黄色、橙
8、色nFL3-红色nFL4-红红色488FL1BP 530/30515-545nmFITC（绿绿色，520nm） FL2BP 585/42564-606nmPE（黄色，（黄色，575nm575nm）FL3670 LP 670nmPE-Cy5、PerCP、PE- Cy7（红色） 635FL4BP 661/16653-669nmAPC（红红色，660nm）流式常见图形 (Histogram Plot)适用于：单参数分析DNA倍体分析抗原表达分析流式常见图形 (Dot Plot)散点图伪彩图假三维图和三维图SSC-HeightFSC-HeightCountsSSC CD45 CD14 等高图和密度图n
9、等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目 相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。n密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方 细胞少。设门与数据分析n门(Gate，简写G)是流式细胞术中的一个重要术语，FCM 数据分析过程实际上就是选门和设门的过程。椭圆形圆形十字门线性门流式分选电荷式分选超声振动器(15-100kHz)液流充电系统高压偏转板收集装置(流式管、培养板)lasers断裂点(充电 )高压偏转板第二节 流式细胞术的科研应用n分析群体细胞n所需时间短n多参数分析n定性或定量流式应用常见范围n细胞大小n细胞的颗粒度n细胞表面分子：CD 系列等n细胞浆内分子：胞内细胞因子
10、等n细胞核内分子：P53n细胞功能检测：细胞周期、凋亡、PH 、Ca+、细胞活性等样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋单细胞悬液 标记荧光抗体检测表型测定细胞分选流式细胞术操作流程统计学分析继续 培养实验标本的处理n单细胞悬液的制备：胰酶消化n抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应n非特异结合的去除：洗涤和封闭封闭：血清和同型抗体细胞染色n染色要求：特异识别某一群细胞，有效区分不同细胞亚群非特异反应水平低抗体效价高，用量适用于常规标本n使用特异的单克隆抗体n最好使用荧光直接标记的抗体n采用适当的阴性对照物n抗体最适滴度抗体的选择n首选直接标记抗体n荧光分子：PE最强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，
11、适用于强表达抗原n间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适合弱抗原的检测实验对照的设计n空白对照：ALLn阴性对照：评估非特异反应水平，界定阴性范围常用同型抗体对照单色分析：设阴性对照（或同型抗体对照）多色分析：阴性对照（或同型对照），单阳性对照 （用于仪器校正），补偿调整管n阳性对照：确定抗原表达正常时的抗原表达强度和百分含 量。（特别在检测阴性时）流式检测应用实例n细胞表面、细胞内分子检测n细胞周期分析n细胞凋亡分析淋巴细胞表面抗原分析n样本来源新鲜抗凝全血PBMCn单克隆荧光抗体染色n溶血n洗细胞n固定n上机检测淋巴细胞细胞内抗原分析n样本来源新鲜抗凝全血PBMCn细胞表面
12、抗体染色n溶血、固定n细胞打孔n细胞内抗体染色n上机检测细胞周期分析：G1MG2SQuiescent cellsG0n处于不同细胞周期的细胞DNA含量不同， G0/G1期细胞含有二倍体量的DNA，G2/M期 细胞含有四倍体量的DNA，而S期细胞DNA 含量处于二倍体和四倍体量之间。nDNA荧光染料能与DNA结合，DNA含量的多 少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度 反应了DNA吸收荧光分子的多少。通过流 式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分 细胞周期的G0/G1期、S期和G2/M期细胞比 例。样品制备10001000rpm 5rpm 5分钟分钟收集收集2X102X106 6个细胞个细胞PBS
13、PBS漂洗漂洗两次两次70%70%酒精酒精4 4度固定过夜度固定过夜收集固定的细胞收集固定的细胞PBSPBS 漂洗漂洗PBS PBS悬浮细胞悬浮细胞2.5l2.5l 10g/l 10g/l RNase A RNase A3737消化消化1 1小时小时过过300300目细胞筛目细胞筛50l 0.1mg/ml PI50l 0.1mg/ml PI （含（含1%Triton)1%Triton)，10001000rpm5rpm5分钟分钟离心离心两次两次混匀，室温混匀，室温静止静止5 5分钟分钟上机DNA 流式检测的主要指标nDNA 含量:ploidy：细胞内染色体DNA含量DI：测定标本的G0/G1期细
14、胞DNA含量与同种系正常细 胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性nPI：增殖细胞占总周期细胞的比例nCV： G0/G1期细胞DNA含量变异系数Annexin V Assay（建议用于悬浮细胞）在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)位 于细胞膜内侧，一旦发生细胞凋亡， 可以从细胞膜的内侧迅速翻转到细胞 膜外侧，使得PS 暴露在细胞膜表面。在Ca2+存在时，Annexin V 与PS 有很 高的亲和力，可与之迅速结合。PS 外 翻发生在细胞核破裂、DNA 片段化以 及凋亡相关蛋白出现之前，这使得 Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期 的一种重要检测标志事件。PI 被用来区分存活的早期细胞和坏死 或晚期凋亡细胞。坏死细胞可以同时 与annexin V-FITC 和PI 结合显色，而 PI 则被排除在活细胞(FITC 阴性)和早 期凋亡细胞(FITC 阳性)之外。 Annexin V-FITC/ PI双染色法双阴：活细胞 Annexin V-FITC单阳：早期凋亡细胞双阳：晚期凋亡细胞 PI 单阳：坏死细胞PI常用于鉴别死细胞。凋亡细胞的细胞膜仍然是完整的，所以 PI不能进入早期凋亡细胞核内。Annexin V-FITCPI活细细胞早期凋亡晚期凋亡 坏死细细胞裸核
