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1、 第七章 微生物的生长及外界因素的影响q微生物的生长与环境条件的关系极为密切 。 q只有当外界供给适当的营养物质，并满足微 生物对各种物理、化学因子的要求之后，微生 物才能正常生长。q如果外界环境条件不适宜，则可以抑制微 生物生长，甚至引起死亡。第七章 微生物的生长及外界因素的影响一、无菌技术t 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；t 在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；第一节 纯培养微生物群体的生长从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。常用的器具：试管、瓶子、培养皿等1、微生物培养的常用器具及其灭菌高温干热灭菌常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌2、接种操
2、作火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行二、获得纯培养的方法v微生物在自然界中不仅分布很广，而且都是混杂 地生活在一起。 v像土壤就是微生物的大本营，哪怕是一粒砂或一 克土中，常生长着多种细菌及其他微生物。 v要想研究或利用某一微生物，必须把混杂的微生 物类群分离开来，以得到只含一种微生物的培养。 纯培培养:微生物学中将在实验室条件下从一个细 胞或一种细胞群繁殖得到的后代称纯培培养。纯培养技术是进行微生物学研究的基础！纯培养的分离，是研究和利用微生物的第一步，是 微生物工作中最重要的环节之一。最常用的方法稀释分离法(平板分离法)稀释平板分离法单细胞挑取法选择
3、培养基分离法等平板划线法涂布平板法三、微生物生长量的测定生长:微生物在适应条件下，不断地吸收营养物质， 组成各种细胞物质，这种重量与体积迅速增加，就是 微生物的生长。繁殖:当微生物的细胞生长到一定阶段，母细胞开 始分裂，产生子细胞，个体大量增加，这就是繁殖发育:这个从生长到繁殖是由量变到质变的过程就 是发育。在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与 研究大生物时有所不同。各种微生物，由于有不同的形态和结构，发育过程 中的生长，表现出的现象也不同。微生物的生长量可以根据菌体细胞数量，菌体体积 或重量作直接测定，也可以用某种细胞物质的含量或某个代谢活动的强 度作间接测定。（一）细胞的
4、数量测定1、细胞总数测定包括死活细胞测定，不详讲，留在实验课中详细讨论 。方法计数器直接测定（血球计数板计数法 ）涂片染色法比浊法2、活菌数测定测定具有繁殖能力的单细胞微生物数量。方法平板菌落计数；最大概率法(MPN)膜过滤法(浓缩法 ) 当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样 品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形 成的菌落进行统计。（二）细胞生物量测定1、干重法v取定容培养物，用离心或过滤的方法将菌体 从培养基中分离出来，洗净、烘干、称重，求 得培养物中的细胞的重量，作为生长量的指标 。v真菌生长量的测定常采用干重法，将培养液 中的振荡培养物过滤，收集
5、菌丝，洗净，或在 洋菜平板培养基上培养的菌体经短时间高温待 洋菜溶化后滤出菌丝。洗净的菌丝，烘干后， 测干重。2、蛋白质测定法细胞的含蛋白质量是比较稳定的，可以从蛋白质量的 测定求出细胞物质量，或者以测定芳香氨基酸量求蛋 白质量，可以测定含全氮量来求蛋白质量（蛋白质量 =氮量x6.25）。3、DNA测定法DNA与DABA2HCl（即新鲜配制的20%W/W、3.5二氨 基苯甲酸盐酸溶液）显示特殊的荧光反应定容培养 物的菌体悬液，应用这种荧光反应强度，求得DNA含 量，可以反映所含的细胞物质量。也可以根据DNA含 量计算出细菌数量，每个细菌平均8.410-5ugDNA三、细菌的生长曲线在纯培养条件
6、下，微生物生长的一般规律是：开始缓 慢，逐渐加快，到达最高阶段后，又逐步下降，直至 衰老死亡；表现出一个曲线式的发展过程。生长曲线单细胞微生物（指细菌），接种到适应的 新鲜液体培养基中，定期的测定细胞数目，以培养时 间为横座标，以细菌对数为纵座标，划出的曲线，称 为生长曲线。 生长曲线延迟期适应期对数生长期稳定期（最高平衡期）衰亡期三、细菌的生长曲线（一）延迟期菌种初接入到新鲜的培养液中，并不立即生长繁殖， 而需要通过自身生理机能的调节以逐步适应新鲜的环 境，因而在这段时间，细胞数几乎不增加，群体的生 长率接近于零，曲线平缓。 滞留期的适应时间长短，因 菌种和培养条件而有差异， 自几分钟到几个
7、小时不等。（二）对数生长期是微生物细胞生理最活跃的时期，在这个时期，微生 物细胞繁殖数目最多，所繁殖的时间也最短，细胞数 目增加（2，4，6，8，16，32，64），以2n增加 的（注：n表示繁殖的次数）。但微生物不能以对数生长速度一直 的繁殖下去，为什么呢？因为营养 物质的不足，代谢物的积累和环境 条件的变化（PH、氧化还原电位、 温度等不适应微生物生长），因而 生长繁殖速度缓慢降下来，而达到 最高生长期。（三）稳定期细胞分裂时间开始延长，曲线上升缓慢，以后部分细 胞停止分裂，少数细胞开始死亡，使新细胞的增加和 老细胞的死亡渐趋平衡。这一时期是细胞内外 积累代谢产物的重要 时期。如抗菌素就在
8、 这期产生，芽孢细菌 在此时形成芽孢。（四）衰亡期环境变得更不利于微生物生长，细胞的生活力继续衰 退，细胞死亡率逐渐增高，活菌数迅速减少，曲线下 降。通过对微生物生长曲线的分 析，反映了一种微生物在一 定生活环境中（试管、摇瓶 、发酵罐）的生长繁殖和死 亡的规律。它即可作为营养 和环境因素影响的理论研究 指标，亦可用做调节控制微 生物的生长发育的依据，指 导微生物生产实践。第二节 环境条件对微生物生长和代谢的影响q微生物在新陈代谢过程中，需要有一定的环 境条件，同时又受到环境条件的影响，其环境 因素的影响很多，有:温度PH湿度等q其影响的过程是错综复杂的，现分别加以 讨论。一、温度（一）微生物
9、对温度的适应范围微生物对温度是敏感的，它对微生物的生长与 生存影响是很大的，它对生活机体的影响表现 在两个方面：（1）随着温度的升高，细胞中的生物化学反应 速度加快，生长速度也加快；（2）机体的重要组成如蛋白质、核酸等物质，对 温度较敏感，随着温度的增高可能使蛋白质、核 酸遭受不可逆的破坏。微生物可生长的温度范围较广，已知微生物可 以在-1290均可生长，但每种微生物只在一 定的温度范围内生长良好，各种微生物有其最适生长温度最高生长温度最低生长温度只有在最适生长温度范围内，微生物生长繁 殖的才最快。根据微生物对温度适应范围不同，可将它们分成:高温性微生物中温性微生物低温性微生物三类。1、高温性
10、微生物 高温性微生物的最适生长温度在4555，它们常见 于温泉、堆肥、厩肥以及其它腐烂的有机物中，堆肥 发酵过程中温度常达6070，象细菌中的芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌，产甲烷杆菌和高温 性放线菌等都属于高温性微生物。分布于温泉中的细菌， 有的可在近100的高温中生长，这些耐高温的微生物， 常给罐头工业，发酵工业带来麻烦。2、中温性微生物 绝大多数微生物都属于这一类，它们最适温 度在2537，中温性微生物室温性微生物体温性微生物2530，主要是 腐生性微生物。37，它们主要 是哺乳动物的寄 生性微生物。3、低温性微生物 q可以在较低温度条件下生长的微生物称之为 低温性微生物。q它们常见于寒带的冻土
11、、海洋、湖泊、冷泉 以及冷藏中， q它们最适温度在1015，向冷藏食品的变 质就是这类微生物引起的。q它们常可在零度以下12的环境中生长。 见P-100。各类微生物生长的温度范围温度适应微生物类型最低温度 最适温度 最高温度高温性 304555 6070中温性 5 2537 4550低温性 0 -121015 2030（二）温度对微生物的影响1、高温对微生物的影响超过最高温度微生物停止生长甚至死亡。这是因为高温能使蛋 白质凝固变性，同时破坏了酶的活力。因而能杀死微生物，所 以可利用提高温度来达到杀菌的目的。灭菌的方法很多，如:干热灭菌 灭菌湿热灭菌 常压灭菌高压灭菌巴斯德消毒煮沸消毒间歇灭菌常
12、规高压灭菌连续加压灭菌火焰灼烧灭菌热空气灭菌灭菌：是应用物理或化学的方法杀死物品上或环境 中的所有微生物的细胞或芽孢。概念 ：一般可用高温、过滤或其它的物理、化学方法使器 皿、培养基或溶器中的所有微生物的细胞及芽孢杀 死或除去。消毒一是应用物理或化学的方法杀死物体上绝大部 分微生物（特别是病原微生物）。物品经消毒处理后，虽然有少数微生物未被杀死 ，但已不致引起有害作用。首先讲干热灭菌干热灭菌火焰灼烧灭菌热空气灭菌直接用火焰灼烧灭菌，对 于接种环，接种针或其它 用具可采用这种方法灭菌 。利用热空气使物体升温， 然后致物体上所带的微生 物由于干热脱水而死亡。灭菌的对象为：玻璃器皿等用具的灭菌，对于
13、带胶皮 的物体，液体及固体培养基等不能用此法灭菌。灭菌设备： 是在烘箱（干燥箱中）进行的， 灭菌条件为：1602小时即可达到灭菌目的。接着讲湿热灭菌湿热灭菌又分成:煮沸消毒法巴斯德消毒法常压蒸汽灭菌、（间歇灭菌）、常规高压灭菌、连续加压灭菌 1、高压蒸汽灭菌： v高压蒸汽灭菌是实验室及生产中常采用的 灭菌法，常压下水的沸点为100，在加压情 况下可提供高于100的温度。v另外蒸汽热穿透力强，可迅速引起蛋白质 凝固，所以高压灭菌是湿热灭菌方法中效果 最好的。v高压蒸汽灭菌常在高压蒸汽锅中进行。它们是一个可密闭的锅子，有的具有夹层，夹层或 锅中可充满饱和蒸汽，并可在一段时间内使之维持 一定温度与压
14、力。使用时要完全排出锅内的空气而 代之以饱和蒸汽。如有空气混存，则锅内温度将低 于同样压力下由纯饱和蒸汽产生的温度，因为纯蒸 汽与其压力间有一定关系。高压蒸汽灭菌不是由于 压力的作用，而是由于蒸汽的高温致死微生物。灭菌的条件为：一般在15磅/平方时（1.05公斤/平 方厘米）蒸汽压，121的温度下处理1530分钟， 可达到灭菌目的。灭菌的对象为：各种耐热物品的灭菌。如一般培 养基、生理盐水等各种溶液、玻璃器皿、工作服等 。灭菌所需要温度与时间取决于被灭菌物品的性质， 体积与容器类型等，对于体积大、热传导性较差的 物品，加热时间常延长。2、连续加压灭菌（continuous autoclavin
15、g ）135-150，5-15秒，工业上发酵培养基 135-150，2-6秒，牛奶或其它液态食品3、间歇灭菌法:灭菌的条件为：将待灭菌物品置阿诺氏灭菌器或蒸锅 （蒸笼）内，常压下100处理1530min以杀死其中 微生物营养细胞，冷后，置于一定温度（2837） 下保温过夜，使其中还可能残留的芽孢发育成营养细 胞，再以同样方法加热处理，如此反复三次，可杀灭 所有芽孢及营养细胞，达到杀菌目的。是用流通蒸汽几次反复处理的灭菌方法。灭菌的对象为：一般只用于不耐热的药品，营养物， 特殊培养基等灭菌。在缺乏高压蒸汽灭菌锅时亦可用 于一般物品的灭菌。缺点：此法灭菌比较费时。4、巴斯德消毒法：这是用较低的温度
16、处理牛乳，酒类等饮料，杀 死其中可能存在的病原菌如结核杆菌，伤寒杆 菌等，而不损害营养与风味的消毒方法。如用 6366，30分钟或71，15分钟处理牛乳， 然后迅速冷却，即可供饮用。致死温度：在一定的条件下和一定时间内，例如十分 钟内杀死微生物的最低温度，称之为致死温度。致死时间：杀死全部微生物体所需要的最短时间， 称之为致死时间。2、低温对微生物影响当温度低于最低温度时，微生物的代谢活动降低 ，接近于停止状态，但仍能存活，一但遇到合适的生活环境就可以生 长繁殖，故此可用低温保存菌种，把一些细菌、放线菌、酵母菌、霉菌接种到琼脂斜 面培养基上，生长好后，就可以放到47的冰箱中 保存。 很多细菌与病毒可保存于-26-70的冰冻条件下 ，所以人们可以利用冷藏法保存食品，以限制其中微 生物的生长而
