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1、药品的卫生学检查方法介绍（北京市药品检验所 戴红）1l无菌室的质量管理l药品的微生物限度检查l药品的无菌检查2无菌室的要求l位置选择l面积大小l洁净度l采光l紫外杀菌l门l人流物流l地面墙面3无菌室的管理l陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备l无菌室应每周和每次操作前用0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污 染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1小时。l人员：肥皂洗手， 0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。l操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间， 手不能来回出入操作台。l在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气 湿气，用紫外灯杀菌半小时。 l非无菌室工作
2、人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。l缓冲间不得放杂物、培养箱等。l定期对门、窗、墙面等消毒。l定期检查洁净度情况。4洁净度的要求应在环境洁净度10000级局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须无菌。工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游 菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。5l尘埃粒子l洁净级别 尘粒数/m3 活微生数（个）/m3l 0.5um 5uml100级 3,500 0 5l1000级 350,000 20,00 100l100000级 3,500,000 20,000 500lGB/T16294-1996l沉降菌l洁净级别 个/
3、（90mm.0.5h）l100级 1 l10000级 3l100000级 106菌种保存、复壮及管理l保存原则 l保存方法l复壮l管理7菌种的保存原则l挑选特征典型的纯菌菌落l确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微 生物都用孢子或芽孢保存l选择最适宜的保存方法进行保存l定期对保存的菌种进行检查8菌种保存的常用方法l琼脂斜面低温保存法l甘油冷冻管保藏法l半固体琼脂斜面低温保存法l液体石蜡保存法l超低温保存法（菌种）l砂土 9菌种的复壮l分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的 分离l通过宿主复壮l淘汰退化l理化因素诱变10菌种的管理l专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得
4、放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等l定期有专人按操作规程进行传代接种l菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研 究处理。l实验菌种不得任意带出l使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处 理11菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26003 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104 生孢梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC(B) 64941 白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98001 黑曲霉(Aspergillus niger) CM
5、CC(F) 98003 大肠埃希菌(Escherichia coli) CMCC(B) 44102 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 6350112菌液的制备（1）l接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中 ， 3035培养1824小时，取此培养 液1ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml，采用 10倍递增稀释法，稀释至10-5 10-7，使 细菌数约为10100cfu/ml。13菌液的制备（2）l接种白色念珠菌的新鲜培养物至改 良马丁培养基中， 2328 培养 1824小时，取此培养物1ml加0.9 无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递
6、增 稀释法，稀释至10-5 10-7，使细菌 数约为50100cfu/ml。14菌液的制备（3）l 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马 丁琼脂斜面培养基上， 2328 培 养57天，加35ml0.9无菌氯化 钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液 ，取1 ml加0.9无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法，稀释至10- 410-6，使细菌数约为50100cfu/ml。 15药品微生物限度检查方法介绍162005年版微生物限度标准的应用 微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生 物污染程度的重要指标，也是对生产企业的设备器具 、工艺流程、生产环境和
7、操作者的卫生状况进行卫生 学评价的综合依据之一。 药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料 的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药 品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查 均以本标准为依据。 检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检 查。172005年版微生物限度标准的分类l1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的 制剂 应符合无菌检查法的规定。l2、口服给药制剂l3、局部给药制剂3.1. 用于手术、烧伤及严重损伤的局部给药制剂无菌3.2. 眼部给药制剂：3.3、耳、鼻及呼吸道吸入给药制剂 3.4、阴道、尿道给药制剂3.5、直肠给药制剂3.6、其它局部给药
8、18l4、含动物组织（包括提取物）的口服给药制 剂l5、有兼用途径的制剂应符合各给药途径的标准l6、霉变、长螨者 以不合格论l7、原料及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行19供试品的抽样及检验取量l一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量的3倍量 （以备复试）。贵重药品检验量可以酌减（至少要够 各种菌检查用的溶液）。l所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位（中药密丸 、膜剂，需取自4丸、4片以上）。l固体及半固体（粘稠性供试品）制剂检验量为10g。l液体制剂检验量为10ml。l膜剂除另有规定外，中药膜剂检验量为50m2,化学药及 生化药膜剂检查量为10cm2。l抽样时，凡发现有异常或可疑的样
9、品，应选取有疑问 的样品，但明显破裂的包装不得作为样品。l凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出 长螨、发霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格 品，无需再抽样检验。20供试品的保存l供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿 冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件 不妥引起致死或繁殖。l供试品在检验之前，应保持原包装状态，严 禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品 。21细菌、霉菌、酵母菌计数22实验前的准备工作l将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试 管、吸管（1ml、10ml）量筒等移到无菌室内，每次试 验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作 中出入，操作编号后将
10、全部外包装（牛皮纸）去掉。l开启无菌室紫外杀菌灯和空气过滤装置，并使其工作 不低于30min。l操作人员用肥皂洗手，关闭紫外灯，进入缓冲间，换 工作鞋。再用0.1%新洁尔灭或其他消毒液洗手或用乙 醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。l操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球（也可用乙 醇棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋的开口处周围，待干 后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。23平板菌落计数法l供试液制备 （10倍递增稀释）l注平皿l倒培养基摇合 （45营养琼脂 玫瑰红钠琼脂 YPD琼脂培养基）l倒置培养 （ 3035 48小时；252872小时）l菌落点数 （30300个 30100个）l菌数报告 （
11、10条原则）24供试液的制备（1）l乳化剂、分散剂、中和剂及其用量应证明是有效的， 并对微生物无毒性。l水浴加温时，温度不超过45，时间不超过30分钟。l供试液从制备到加入培养基，不超过1小时。l供试液的体积：最终体积为100ml。25供试液的制备（2）l稀释剂：pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液l肠溶制剂pH7.6磷酸盐缓冲液、 pH6.8磷酸盐缓冲液l非水溶性供试品乳化剂：5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚 山梨酯80的无菌混合物（事先配制好、灭菌消 毒）。十四烷酸异丙酯萃取或过滤26供试液的制备（3）液体供试品 取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂至 100ml ，摇匀，作为1
12、:10供试液。含王浆或蜂蜜的液体制剂和滴眼剂直接用供试品作为供试液。l固体、半固体或粘稠供试品，称取供试品10g，置于匀浆杯或适 当灭菌容器中，加入稀释剂至100ml ，用匀浆仪（3000-5000r/ ，24min）、振荡器或乳钵研磨等方法混匀。胃溶胶囊加稀释 剂后置451水浴振摇，肠溶胶囊加无菌磷酸盐缓冲液后 451水浴振摇。27供试液的制备（4）l非水溶液性供试品 软膏剂、乳膏剂、称供试品5g（5ml），加 到含已灭菌溶化并45保温的乳化剂的烧杯中，用无菌玻棒搅拌 混匀后，慢慢加入45左右的稀释剂85ml，边加边搅拌，使供试 品充分乳化，作供试液（1:20）。l油剂取供试品10ml，加入
13、无菌聚山梨酯80 5 8ml，摇匀，再 加入稀释剂至100ml。l栓剂，称取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加适量稀释剂，置45水浴保 温10min，使溶，加入灭菌聚山梨酯80 58ml，振摇使之乳化，再加稀 释剂（稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml），摇匀。28供试液的制备l气雾剂 ，将供试品置冰箱（4-8）1h，取出，用碘伏棉球（也 可用乙醇棉球）擦拭试品开启部位周围，然后以无菌钢锥钻 孔 并插入容器中，勿移出钢锥 ，以转动 方式使容器抛射剂全部抛 出。以无菌注射器吸出全部溶液，按标示量补加稀释剂 至足量 （若含非水溶性成分，加适量无菌聚山梨酯80液）此液即为供 试品原液。l膜剂 将药膜剪
14、成碎片，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂 至100ml ，于451水浴中保温，振摇使溶。l茶剂，取供试品10g，置灭菌锥形瓶中，加入稀释剂 至100ml， 振摇30s,以灭菌纱布过滤 ，（如为袋泡茶，可直接取2袋，以称 样结 果按1：10加稀释剂 ，浸泡30min）。l以上供试品如吸水膨胀，或粘度过高，可增加稀释剂 ，制成 1:201:100供试液。 29供试品溶液的制备（5）（含抑菌成分的供 试品）稀释法：10ml供试液种入较大体积的培养基中，一般不超过1000ml离心沉淀法：3000rpm，30min，底部2ml稀释至10ml。500rpm,5min，上清 液再离心集菌薄膜过滤法：0.45um的
15、滤膜，冲洗3次，每次至少100ml中和法：磺胺类 100ml增菌液中含1%的对氨基苯甲酸1ml砷、汞类 100ml硫乙醇酸盐培养基洗必泰类 100ml增菌液中加适量的聚山梨酸80等表面活性剂沉降法：自然沉降5min，取上层液置100ml增菌液中30供试液的稀释（10倍递增稀释法）l10g 100ml 1:101ml 10ml 1:1001ml 10ml 1:1000l至少3个稀释级，每递增1个稀释级，必须更换吸管。l管内混合吹打不少于10次，吸液在液面下2.5cm处，放 液在液面上1cm处，延内壁缓缓吹出全部溶液，然后 将吸管放入消毒液缸内。31注平皿l在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取 各种稀释液各1ml至每个灭菌平皿中（从高稀释级至低
