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1、华中科技大学硕士学位论文低密度脂蛋白诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化的作 用研究姓名：陈雪申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：阮秋蓉20080501华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 1低密度脂蛋白诱导骨髓间充质低密度脂蛋白诱导骨髓间充质 干细胞向平滑肌样细胞分化的作用研究干细胞向平滑肌样细胞分化的作用研究 摘摘 要要 背景背景 动脉粥样硬化(artherosclerosis, As)是许多心脑血管疾病发生的前期病理基础。在高脂等因素所致的 As 发生过程中，平滑肌细胞增生并合成细胞外基质是其重要的环节。 传统观念认为， 病变中的平滑肌
2、细胞来源于病变部位的动脉中膜。然而最近研究结果表明，病灶部位的平滑肌细胞并非完全来自于中膜，骨髓来源的细胞在一定的情况下可以定向分化为平滑肌细胞参与动脉粥样硬化的发生与发展。 目的目的 探讨低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells，BMSC)向平滑肌样细胞分化及 myocardin 在其分化过程中的作用。 方法方法 用差异贴壁法分离纯化原代骨髓间充质干细胞，在不同浓度血清诱导BMSC 分化条件下加以 LDL 刺激，检测 BMSC 分化过程中 myocardin 及平滑肌细胞表面标志平滑肌肌动蛋
3、白(-smooth muscle actin，-SMA), 平滑肌肌球蛋白重链(smooth muscle myosin heavy chain, SM-MHC)以及 SM-22 的表达。 细胞分为: 常规培养组(含低糖-DMEM 培养基，10胎牛血清，3谷氨酰胺)，常规培养+LDL 刺激组(25mg/L)，20%FBS培养组，20%FBS培养 +LDL 刺激组。、组分别在培养 24 小时、48 小时和 72 小时后加入 LDL，各组细胞均培养 96 小时。免疫细胞化学检测 myocardin、-SMA 及 SM-MHC 的表达，结合形态学鉴定 BMSC 向平滑肌样细胞分化的情况；逆转录-聚合
4、酶链反应法(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测 myocardin、-SMA 及 SM-22 mRNA 的表达。 结果结果 光镜显示 BMSC 随着诱导时间延长逐渐由小圆形、多角形转变为长梭华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 2形。免疫细胞化学结果显示常规培养+LDL 刺激组、20%FBS 培养组、20%FBS 培养 +LDL 刺激组分别与常规培养组相比 myocardin、-SMA 及 SM-MHC 蛋白的表达增强，差异有统计学意义(P0. 05，n=9)；相同 LDL 作用
5、时间点，20% FBS 培养+LDL 剌激组与常 规培养+LDL 剌激组相比上述三种蛋白的表达明显增强, 差异有统计学意义(P0. 05， n=9)； 相同 LDL 作用时间， 20%FBS 培养+LDL培养组与常规培养+LDL 培养组相比上述三个基因 mRNA 的表达明显增强, 差异有统计学意义(P0. 05，n=9)；-SMA、SM-22 mRNA 表达与 myocardin 表达呈正相关(r=0.9295，P0.05; r=0.8940，P0.05)。 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 22讨讨 论论 众所周知，低密度脂蛋白在高脂等因素所致的动脉粥样
6、硬化发生过程中起着重要的作用。传统的观念认为，病变中的平滑肌细胞来源于病灶部位的动脉中膜。然而最近研究结果表明，病灶部位的平滑肌细胞并非完全来自于中膜，骨髓来源的细胞在一定的情况下可以定向分化为平滑肌细胞参与动脉粥样硬化的发生与发展3-5。此外，有研究表明当 LacZ 阳性小鼠接受 LacZ 阴性小鼠的心脏移植后，移植心脏冠状动脉 4 周后出现了再狭窄，在狭窄动脉的新内膜中出现了 LacZ 阳性细胞，而且，新内膜中部分 LacZ 阳性细胞还表达平滑肌细胞特异性标志， 说明狭窄动脉新内膜中平滑肌细胞并非由冠状动脉中膜的平滑肌细胞迁移而来而是来自受者血细胞，提示斑块中的平滑肌细胞不仅仅来自中膜平滑
7、肌细胞。Sata3等在高脂血症诱发的动脉粥样硬化实验中发现骨髓细胞参与了动脉粥样硬化斑块形成，斑块中这些骨髓源性细胞还表达部分平滑肌细胞特异性标记，这说明骨髓来源的细胞可能参与了动脉粥样硬化的形成，也提示了动脉粥样硬化危险因子如低密度脂蛋白等对血管的损伤可能诱导骨髓源性细胞的归巢和分化，使其成为斑块中平滑肌细胞的重要来源。 为了探讨LDL是否能诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化，本实验在体外培养骨髓间充质干细胞的不同时间点上加以LDL剌激。结果显示myocardin、-SMA、SM-22 及 SM-MHC在LDL作用48小时表达最强。证明LDL可诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化。然而
8、，实验同时提示，当LDL作用时间超过48小时后， 细胞皱缩， 从长梭形变成多角型且数目相对减少， 部分细胞甚至凋亡， myocardin, -SMA及SM-22 mRNA表达也有所下降，这可能与LDL积蓄所致的细胞毒性作用有关。有实验表明，高浓度的血清可诱导骨髓间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化11-13。为了研究LDL联合20%FBS血清是否能诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化，本实验采用不同浓度血清体外诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化，同时在不同诱导时间点上加以LDL剌激。 实验中发现， 20%血清可以诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化，与文献报道11-13相符。同时我们发现my
9、ocardin在LDL作华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 23用48小时、20%FBS培养+LDL剌激组中表达最强；-SMA、SM-22 及 SM-MHC表达也最强。相同LDL作用时间点内，20%FBS培养+LDL剌激组上述指标的表达均比常规培养+LDL剌激组强，证明LDL联合20%血清比单独采用20%血清诱导骨髓充质干细胞向平滑样细胞分化的作用更强。 此外实验中我们发现， 在LDL联合20%血清诱导骨髓间充质干细胞分化过程中， 虽然LDL作用时间超过48小时后myocardin, -SMA 及SM-22 mRNA表达也下降，但并不如LDL单独诱导时下降明
10、显，这可能与高浓度血清诱导作用有关。大量的研究证实-SMA是平滑肌细胞分化早期的标志基因，SM-22 是其分化中期的一个重要标志， 而SM-MHC则是成熟平滑肌细胞的特异性标志之一。但有实验提出，骨髓间充质干细胞也表达-SMA 14. 因此，仅仅是-SMA在剌激后表达的增强并不能充分说明其向平滑肌样细胞分化。本实验在检测a-SMA的同时检测了平滑肌细胞分化中晚期的标志性基因SM-22、SM-MHC的表达情况，发现a-SMA、SM-22 及SM-MHC的表达均在LDL作用48小时、20%FBS培养+LDL剌激组中表达最强。可证明LDL联合高浓度血清确实能更有效地诱导骨髓充质干细胞向平滑肌样细胞分
11、化。 Myocardin 是迄今为止发现的促血管平滑肌细胞分化最关键的因子。 Yoshida10,15等在研究 myocardin 促平滑肌细胞分化的机制中发现，myocardin 仅表达于胚胎发育期和成年个体的平滑肌组织和心肌组织，而在小鼠胚胎干细胞内并不表达，但在向平滑肌细胞分化过程中出现的 myocardin 的表达。同时，myocardin 在许多非平滑肌细胞的强制性表达可转录激活平滑肌细胞特异性的转录调节元件的表达16-18。此外，myocardin 显性负相突变体蛋白的强制性表达或 myocardin 基因的敲除可有效地降低平滑肌细胞特异性基因的活性10,15。最令人吃惊的是，my
12、ocardin 基因缺如的胚胎仅能存活 E10. 5 天且没有出现任何向平滑肌细胞分化的迹象19。这些研究说明myocardin 是平滑肌细胞分化所必需的因子。研究表明，myocardin 促平滑肌细胞分化的机制主要是通过与 SRF 结合来调控平滑肌基因的表达如 -SMA、SM22、SM-MHC 等15,20。 与此研究结果一致的是在胚胎干细胞内，myocardin 的强制性表达则可以转录激活内源性 SM22 启动子并诱导大量内源性基因的表达包括 -SMA、华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 24SM22 及 SM-MHC 等3。本实验研究发现，在骨髓间充质
13、干细胞向平滑肌样细胞分化过程中 -SMA、SM22 mRNA 的表达与 myocardin 呈正相关，证明 myocardin 表达的增加可促进平滑肌细胞特异基因的表达，从而促使骨髓间充质干细胞向平滑肌样细胞分化。 本实验证实了 LDL、20%血清可使 myocardin、-SMA、SM-22 与 SM-MHC表达增加；LDL 联合 20%血清可使上述指标表达的增加更为显著；-SMA、SM22 mRNA 的表达与 myocardin 呈正相关。证明 LDL 与 20%血清均可诱导骨髓充质干细胞向平滑肌样细胞分化，LDL 联合 20%血清诱导作用最强，且 myocardin 在此分化过程中发挥重
14、要的作用，为后继的实验中通过用 RNA 干扰技术阻抑 myocardin 基因表达，阻止骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞提供实验依据 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 25结结 论论 LDL，20%FBS 均可诱导 BMSC 向平滑肌样细胞分化。LDL 联合 20% FBS诱导 BMSC 向平滑肌样细胞分化的作用最强。myocardin 可能在此过程中起重要作用。 A-1 A-2 B-2 图 A MSCs （200） A-1 为 MSCs 第 5 天 A-2 为 MSCs 加入 LDL 48 小时 图 B -SMA 免疫细胞化学结果 （200） B-1 2
15、0%FBS+LDL 作用 48 小时 MSCs 中 -SMA 胞浆阳性表达 B-2 SMCs 中 -SMA 胞浆阳性表达 B-1华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 26图 C SM-MHC 免疫细胞化学结果 （200） C-1 20%FBS+LDL 作用 48 小时 MSCs 中 SM-MHC 胞浆阳性表达C-2 SMCs 中 SM-MHC 胞浆阳性表达C-1C-2 D-1D-2 图 D myocardin 免疫细胞化学结果 （200） D-1 20%FBS+LDL 作用 48 小时 MSCs 中 myocardin 胞核阳性表达 D-2 SMCs 中 my
16、ocardin 胞核阳性表达 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 27Figure E The protein expression of myocardin, -SMA and SM-MHC during LDL promote the differentiation of BMSCs into smooth muscle-like cells lane 1 regular culture group 2-4 regular culture +LDL group：24h, 48h, 72h 5 20% FBS culture group 6-8 20%FBS culture+LDL group：24h, 48h, 72h P 0. 05 vs regular
