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1、成都中医药大学硕士学位论文 50附件三：声明 附件三：声明 硕士学位论文： 电针对 AD 模型小鼠 SAMP8 海马神经元NCAM、NFkB 表达的影响是本人在成都中医药大学攻读硕士学位期间在导师指导下完成的，该论文成果归成都中医药大学所有。有关学位论文成果的开发、转让、论文发表等，均需征得导师和成都中医药大学同意。 硕士生签名： 导师签名： 成都中医药大学硕士学位论文 6前前 言 言 神经变性疾病的神经康复是世界医学研究的热点之一。目前，神经变性疾病以其高发病率、高危害性、高社会经济负担成为影响国民健康水平的重要问题，引起世界各国政府的重视。美国国立卫生院（NIH） 近年来每年投入神经变性疾
2、病研究的基金数额均在 10 亿美元以上，且逐年增加；我国科技部“973”计划也将“神经变性疾病的机制和防治”纳入 2005-2006 年生命科学重大基础研究项目。在众多的神经变性疾病中，老年性痴呆（Alzheimers disease,AD）已成为老年人群中继心血管病、肿瘤和卒中之后第四位致死病因，且因其快速增长的势头而备受嘱目。作为神经变性疾病治疗的重要环节，神经康复自然成为了医学界不断追逐的热点和难点。 大量的临床研究表明， 针灸疗法对于神经变性疾病老年性痴呆有较好的疗效，在促进运动能力恢复，改善学习记忆障碍，减轻精神神经症状等方面具有明显的优势1-3。目前，在针灸研究领域，已有研究者从神
3、经递质4、5、血浆 NO6、细胞因子7、自由基8、信号传导9、能量代谢10-12等方面进行过相关探讨。本课题组在前期研究中初步证实，电针能够促进 C-Fos 蛋白表达，诱导内源性 NGF 的合成，从而增大突触数密度和面密度，降低突触平均面积，促进海马神经元突触形态可塑性的发挥，提高 AD 大鼠的学习记忆能力13。本实验的同期研究业已证实， 电针能够有效影响 SAMP8 海马神经元 PSD、 界面曲率、间隙宽度，从而影响突触形态可塑性14。 研究发现，海马神经元突触可塑性的变化在 AD 的病理变化中占有重要的地位，它可能是 AD 学习记忆功能障碍的神经生物学基础15-17。临床研究也显示，在众多
4、治疗 AD 的药物中18，能够对海马神经元突触可塑性施加影响的药物如 NGF、黄皮酰胺等有着良好的应用前景19、20。随着研究的不断深入，人们发现，突触形态可塑性的发挥除了需要 NGF 等神经营养因子的营养作用外， 神经元细胞之间的粘附成都中医药大学硕士学位论文 7现象及其作用可能是突触形态可塑性发挥的又一重要的、关键性环节。而其中神经细胞粘附分子（Neural Cell Adhesion Molecule，NCAM）在突触可塑性中的作用格外引人瞩目21。新记忆的形成在一定程度上需要新蛋白的合成22，核因子 kB（Nuclear Factor Kappa B，NF-kB）作用一个核转录因子，其
5、活性程度可能直接影响到新蛋白的合成，研究显示，NF-kB 在记忆存储存过程中是必需的23，另有报道NF-kB 能调控 NCAM 的表达24。 因此， 本课题在前期研究的基础上13， 14， 以快速老化小鼠 （SAMP8）为载体，通过研究电针对海马神经元 NCAM、NF-kB 表达的影响，从神经细胞粘附角度探讨针灸神经康复的可塑性机制，为 AD 乃至其它神经变性疾病的针灸临床治疗，提供科学的实验依据。 成都中医药大学硕士学位论文 8实实 验验 研研 究究 第一部分 第一部分 电针改善 AD 模型 SAMP8 学习记忆能力的行为学研究电针改善 AD 模型 SAMP8 学习记忆能力的行为学研究 1.
6、 实验材料 1. 实验材料 1.1 动物 1.1 动物 8 月龄 SAMP8 小鼠 24 只，8 月龄 SAMR1 小鼠 12 只，全为雄性，体重 202g，全部由天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心提供。合格证号：W-J 津实动质 M 准字第 006 号。动物饲料由四川省医学科学院实验动物研究所提供。 饮水及饲料经高温蒸汽灭菌，动物在实验前适应性驯养 1 周，动物房温度 2226，湿度维持在 55%左右。 。 1.2 主要仪器 1.2 主要仪器 Morris 水迷宫：由成都泰盟科技有限公司提供（图 1.1） 。包括一个不锈钢的圆形水池（直径 90cm，高 50cm， ） ，隐藏在
7、水面下的平台 （直径 9cm， 高 28cm） 以及一套图象自动采集和处理系统 （摄像机、录像机、显示器和分析软件等） 。将水池等分为 4 个象限，任选其中1 个象限， 正中放置圆柱形平台， 平面没于水面下 2cm。 水池注水 30cm深，并加入奶粉，使水成不透明乳白色，水温保持在（241） 。 成都中医药大学硕士学位论文 9图 1.1A Morris 水迷宫视频跟踪分析系统 图 1.1B 迷宫分析软件界面 ? 计算机：方正集团公司产品 ? 小鼠固定器：自制 ? G6805-1 型电针仪：青岛鑫生实业有限公司，编号：20030561 ? 华佗牌无菌针灸针：苏州医疗用品厂有限公司，规格：0.25
8、mm40mm 2. 实验方法 2. 实验方法 2.1 动物分组 2.1 动物分组 采用计算机随机的方法， 将 SAMP8 小鼠随机分为模型组、 电针组，每组各 12 只；SAMR1 小鼠 12 只作为空白组。 2.2 治疗方法 2.2 治疗方法 电针组：用自制固定器固定小鼠。参照中国针灸学会实验针灸分会制定的动物针灸穴位图谱25，选取“百会” 、 “涌泉” （ “百会”向前斜刺 35mm； “涌泉”直刺 23mm，双侧交替进行） 。进针后，不进行手法刺激，连接 G6805 电针仪进行治疗，施以疏密波，频率 2100HZ，电压 24V，强度逐渐加大到小鼠下肢轻微抖动为度，留针 20min，每日
9、1 次，7d 为一疗程，疗程间隔 1d 进行下一疗程，共成都中医药大学硕士学位论文 103 个疗程，计 21d。 模型组：不施针，每天以同样的方式，于同样的时间和程度进行抓取、固定。 空白组：不施针，每天以同样的方式，于同样的时间和程度进行抓取、固定。 2.3 学习记忆能力测试学习记忆能力测试 采用 Morris 水迷宫，进行定位航行实验和空间探索实验测试，对 SAMP8 学习记忆能力评价。 2.3.1 行为学测试行为学测试 2.3.1.1 习惯化（habituation） 2.3.1.1 习惯化（habituation） 在进行训练前1d,将所有动物放入不含平台的水迷宫中自由游泳2min，使
10、其熟悉环境以达到到习惯化。 2.3.1.2 定位航行实验（place navigation experiment） 2.3.1.2 定位航行实验（place navigation experiment） 评价时间点：模针组治疗结束后（即实验开始后第 32d） 。 评价内容：逃避潜伏期（从入水至找到平台的时间） 。 评价方法：参照文献26描述的方法进行操作：测试历时 5d，每天上下午各 1 次，平台中点离池壁 22.5cm 在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，将小鼠面向池壁分别从 2 个入水点放入水中，记录在 120s 内寻找平台的时间，即逃避潜伏期（escape latency） 。如
11、果小鼠在 120s 未找到平台，将其引至平台，此时潜伏期记为 120s。每次间隔壁 60s。测试结束后，将小鼠放回鼠笼，用吹风机烘干鼠毛并注意保暖。每天在 2 个入水点各训练 1 次，以两次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。 成都中医药大学硕士学位论文 112.3.1.3 空间探索实验（space probe experiment） 2.3.1.3 空间探索实验（space probe experiment） 评价时间点： 最后一次定位航行实验结束后 （即实验开始第38d） 。 评价内容：小鼠在原平台所在象限的停留时间。 评价方法： 撤除平台， 将小鼠放入原平台对侧象限中点的水中
12、（面朝池壁放入） ，记录其在 120s 内搜索平台的路线图。迷宫系统自动记录小鼠在原平台所在象限停留的时间。 2.4 统计学处理 2.4 统计学处理 采用 SPSS12.0 统计软件对数据进行分析， 数据均用均数标准差（xss）表示。定位航行实验采用重复测量数据方差分析方法（REPEATED MEASURES） ，空间探索实验采用多元方差分析方法（MULTIIVARIATE） 。 3. 结果与分析 3. 结果与分析 3.1 定位航行实验结果与分析 3.1 定位航行实验结果与分析 表表 1 各组小鼠平均逃避潜伏期比较（单位：各组小鼠平均逃避潜伏期比较（单位：s） 组别 N 第一天 第二天 第三天
13、 第四天 第五天 空白组 12 36.475.47 32.776.5223.386.9315.252.69 11.482.61模型组 12 68.462.87 61.702.42 63.653.43 63.773.16 64.183.46 电针组 12 61.252.76 54.724.60 52.984.1250.532.21 47.452.72注：与模型组比较：P0.05。提示：电针能提高 SAMP8 海马区NCAM 蛋白表达水平。 3.1.2 原位杂交检测结果 3.1.2 原位杂交检测结果 表4：各组小鼠海马区NCAM阳性表达平均光密度比较（表4：各组小鼠海马区NCAM阳性表达平均光密度
14、比较（xs） s） 组 别 N 平均光密度 空白组 6 0.4680.015 模型组 6 0.3830.017 电针组 6 0.5280.016 与模型组比较 P0.05。提示：电针能提高 SAMP8 海马区NF-kB 蛋白表达水平。 3.3.2 原位杂交检测结果 3.3.2 原位杂交检测结果 表6：各组小鼠海马区NF-kB 阳性表达 平均光密度比较（表6：各组小鼠海马区NF-kB 阳性表达 平均光密度比较（xs） s） 组 别 N 平均光密度 空白组 6 0.3150.013 模型组 6 0.2130.013 模针组 6 0.3080.001 表示和模型组比较 P0.05。提示：电针能提高
15、SAMP8 海马区NF-kBmRNA表达水平。 成都中医药大学硕士学位论文 22讨 论 讨 论 1. AD 的中医认识及穴位选择 1. AD 的中医认识及穴位选择 中医虽无 AD 的病名，但 AD 以智能下降、学习记忆能力减退、呆傻愚笨、以及日常生活能力、社交能力和行为人格改变为主要临床特征，可归属于祖国医学中“癫疾” 、 “狂证” 、 “郁证” 、 “文痴” 、 “呆症”和“健忘”等范畴。 多数医家认为痴呆发病与心、脑、肾关系密切，年老体衰、肾精不足、髓海空虚是其常见的病因病机。其病性特点为本虚标实。本虚为脏腑亏损、脑窍失养，其中以肾虚髓空为主；标实为痰阻血瘀、清窍蒙蔽，其中以督脉不通为要。 从脏腑理论来看，肾藏精，主骨生髓，为先天之本。肾中精气的盛衰在人的生长壮老已中发挥着主导作用。脑为髓海，亦属肾中精气所化生，并始终依赖肾精的充养。肾精充盛则髓海得养，脑窍充实而令人智慧聪颖；肾精亏虚则髓海失养，脑窍空虚而致神机失用发为呆病。因此，随增龄而发生的肾精亏损，髓海失养被认为是脑衰老和老年期痴呆发生的最基本的病因病机。 从经络理论来看，督脉被称为“脑之经脉” 。督脉起于长强，并于脊里，直入于脑，分支两络于肾，又有支脉贯心，可将肾之精、心之神以及其他脏腑之精微上输脑髓，充养元神。脑髓虽然依赖以肾精为主的脏腑精气的充养，但这一过程却依赖督脉经气之转输与灌注。诚如
