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1、中文摘要的核心区，该区包含有胱氨酸序列。与V E G F c 一样，V E G F 。D 的受体同样有V E G F R 一3 ( 又称F l b 4 ) 和V E G F R 一2 ，前者主要分布于成年组织的淋巴管内皮，后者则主要在血管内皮上表达，V E G F D 与V E G F R 3 结合可促进淋巴管新生。迄今已有研究显示V E G F D 的表达与大肠癌淋巴结转移关系密切，但有关V E G F D 表达与大肠癌组织微淋巴管密度( 1 y m p h a t i cm i c r o v e s s e ld e n c i t y ，L M V D ) 关系的研究甚少。本研究旨在探
2、讨人类大肠癌中V E G F D 表达与大肠癌组织微淋巴管密度与肿瘤转移的关系。研究内容和结果如下：1 大肠癌淋巴管新生与淋巴结转移的关系目的：探讨人类大肠癌组织中有无淋巴管新生，并分析微淋巴管密度与淋巴结转移的关系。方法：采用5 - N a s e A L P a s e 双重染色方法，对5 6 例大肠癌及正常组织和1 0 例大肠腺瘤的淋巴管和血管进行染色，计数微淋巴管密度( L M v D ) 。结果：1 1 大肠癌新生淋巴管的形态学特征1 1 1 光镜下正常肠壁及腺瘤内淋巴管特点：淋巴管为5 - N a s e 染色阳性( 棕色) ，血管为A L P a s e 染色阳性( 蓝色) 。在
3、正常肠壁内，淋巴管多与血管伴行，位于粘膜及粘膜下层，管腔较血管大，管壁薄，形态不规则。淋巴管在粘膜内围绕着腺体分布。一些散在细胞及平滑肌细胞也显示有弱的5 - N a s e 活性。腺瘤内未见明显淋巴管新生，淋巴管分布及形态学与正常粘膜相似，但其间质内可见大量蓝染的血管。1 1 2 光镜下大肠癌淋巴管形态学特征：肿瘤组织内部及周边可见大量淋巴管。位于肿瘤内部的淋巴管呈条索状，分布中文摘要于癌巢之间，很少有开放管腔。肿瘤坏死区也可见淋巴管存在。位于肿瘤周边部的淋巴管则多呈扩张或极度扩张状态，偶可见到盲端、分支及瓣膜。无论肿瘤内部还是周边部的淋巴管均不与血管紧密伴行，而呈杂乱分布。1 2L M V
4、 D 与淋巴结转移的关系1 2 1 大肠癌L M V D 与正常肠壁、大肠腺瘤L M V D 的比较5 6 例大肠癌L M V D 为2 3 0 4 8 1 9 ，正常肠壁L M V D 为3 3 0 1 4 2 ，1 0 例腺瘤L M V D 为4 6 0 1 5 8 。大肠癌与后两者相比，有显著性差异( P - - - 5 l 为3 分。染色强度与阳性细胞率的乘积：0 2 分为( ) ，3 - 4 分为( + ) ，5 - 7 分为( + + ) ，8 - 9 分为( + + + ) 。3 统计学处理利用S P S St 0 0 软件，采用t 检验和方差分析，P 一5 0 y T u m
5、o rs i z e 5 c m5 c mD e g r e eo fD i f e r e n t i a t i o n W e l l M o r d e r a t eP o o r l yD e p t ho fI n v a s i o nT 1 一T 2 T 3 T 4L y m p hn o d e M e t a s t a s i s N O N l N 2 N 33 32 31 44 22 43 22 12 871 2 3 772 l2 0962 61 593 21 62 516 ( 7 6 2 、18 ( 6 4 3 17 ( 1 0 0 )8 ( 6 6 7 12 7
6、 ( 7 2 9 、 6 ( 8 5 7 、1 11 8667851 0871 2 7 30 3 5 70 7 5 90 4 8 70 9 1 80 3 7 5)1 03 7 9 40 1 5 0O41 0O 8 2 l0 6 6 311 0三9 9 1 3o 0 1 9 j0研究论文讨论1 大肠癌淋巴管新生与淋巴结转移的关系最近1 0 年来通过对血管新生机制的研究发现，人类肿瘤可能侵入新生的血管发生血行转移。然而对于淋巴管转移，仅在动物模型及少数人类肿瘤中发现有淋巴管形成，其中一个重要的原因是缺乏特异的淋巴管标志物。目前关于淋巴管在人类肿瘤中的作用尚有许多争论。本课题采用酶组织化学方法，观察
7、人类大肠癌有无淋巴管新生，并分析淋巴管在大肠癌淋巴结转移中的意义。1 1 大肠癌是否存在淋巴管新生5 口- N a s e 在淋巴管中的活性较高而在血管中活性则很低。相反，A L P a s e 在淋巴管中活性很低而在血管中则活性较高。因此，5 3 N a s e A L P a s e 双重染色技术可以清晰地区分组织中的血管和淋巴管，是目前较为成熟的显示淋巴管的方法 4 , 5 1 。5 口- N a s e 活性高低在一定程度上反映了淋巴管的功能状态，淋巴管通透性及吸收功能越强，其内皮细胞的5 1 3 。N a s e 活性也越强。与B e a s l e y l 6 J 等人在头颈部癌中
8、用L Y V E 1 标记淋巴管的结果相似，我们发现在大肠癌内部及周边有大量淋巴管存在，其中肿瘤内部的淋巴管多呈条索状，而周边部淋巴管多呈扩张甚至极度扩张状。这些淋巴管的形态学特点很像体外V E G F诱导的新生血管网结构，提示这些淋巴管可能是新生的。B e a s l e y 还对肿瘤淋巴管的核增殖抗原K i 6 7 进行染色，结果发现肿瘤内部的小淋巴管为阳性，而肿瘤周边的大淋巴管和正常组织的淋巴管内皮不显色，证实肿瘤内部研究论文小淋巴管确为新生，而肿瘤周边的淋巴管可能是早已存在的。但是，我们用5 1 N a s e 标记淋巴管并未发现肿瘤内部的淋巴管显色与肿瘤周边及正常组织有差别，另外我们
9、在腺瘤的不典型增生区域检测到了V E G F D 表达，却未发现有淋巴管增多。所以，作者认为肿瘤内部及周边部淋巴管可能均伴随着肿瘤发生而形成，只是周边部大淋巴管成熟较早。关于淋巴管起源，有两种学说，一种认为淋巴管发自静脉上的淋巴管囊泡，另一学说则认为淋巴管起于间质中的淋巴管胚细胞。目前还不清楚肿瘤“淋巴管新生开关”( L y m p h a n g i o g e n e s i sS w i t c h ) 是如何启动的。在对肿瘤血管新生的研究中发现，在腺瘤到腺癌的发展过程中血管密度呈缓慢增高趋势，这是由腺瘤内血管延伸造成的，并非血管新生所致。一旦腺癌形成，血管新生开关即被激活【”。从本实验
10、结果看，淋巴管新生似乎略迟于血管新生。1 2 肿瘤内及周边部新生淋巴管的功能淋巴管形成后，其管腔开放与否主要取决于周围环境。生理情况下，当组织间液体增多、压力增高时，淋巴管周围的锚丝收缩，淋巴管随之开放，其管壁通透性增加，更多的间质液体及大分子物质便进入淋巴管并被运输至低压区，从而保持了内环境的稳定f s 】。但肿瘤内部的问质成分和结构经常发生变化，在这种情况下，肿瘤间质中的液体通道可能不会直接按正常方式引导液体进入淋巴管。间质压力的明显增高，一方面可能压迫肿瘤内部淋巴管呈闭缩状态，另一方面还可导致肿瘤内部与边缘研究论文的压力差增加，促使液体自肿瘤中央区向周边区溢出，肿瘤细胞便可能随之脱离原发
11、灶而进入周边部扩张的淋巴管【9 】。所以，推测肿瘤细胞不是直接利用肿瘤内部的淋巴管发生转移的，而很可能是随液体溢出到肿瘤边缘后进入该区域扩张的淋巴管的。最近，S e d i v y 等人在口腔癌边缘的淋巴管内观察到有瘤栓存在【l o l 。N a k a y a m a 等人还发现大直径的淋巴管与肿瘤浸润程度明显相关 1 i 1 。本实验未见到这一现象，这可能是因为5 口N a s e A L P a s e 染色采用的是新鲜组织冷冻切片，在染色过程中淋巴管内的瘤栓被冲洗掉了。由上述结果我们初步认为，肿瘤周围淋巴管的价值较为肯定，但对肿瘤内小淋巴管的功能尚需进一步研究。1 3 大肠癌L M V
12、 D 与淋巴结转移的关系我们发现大肠癌的平均L M V D 与正常肠壁和腺瘤相比显著增多，这与W h i t e 等人的研究结果一致 1 2 1 。有学者报告宫颈癌及胃癌的L M V D 与正常组织相比呈增高趋势，但并无统计学差异 1 3 , 1 4 1 。在子宫内膜癌、宫颈癌中，L M V D升高常提示预后差 1 5 j 6 】。本实验中，L M V D 与淋巴结转移密切相关，提示淋巴管新生可能不断为周边淋巴管提供补充，而肿瘤周边淋巴管的增多，又为肿瘤细胞向淋巴管转移提供了更多的机会。L M V D 有望成为判断大肠癌预后的个指标。本研究还显示，L M V D 与肿瘤浸润深度有关。肿瘤侵犯越
13、深，L M V D 值也越大。究其原因，可能是在肿瘤生长过程中，随着浸润程度的加深，肿瘤细胞分泌V E G F C 、V E G F D 等因子的量会发生明显变化，从而促进淋巴管新研究论文生加快。这一现象或可在一定程度上解释肿瘤演进( P r o g r e s s i o n ) 的机理。尽管如此，仍有研究提示并非所有类型肿瘤的L M V D 与其淋巴结转移有关 1 7 , 18 1 。可见，肿瘤的转移是一个相当复杂的过程，除与淋巴管新生有关外，还与肿瘤细胞的浸润能力、基底膜的完整性等因素等有关。本实验中，肿瘤分化程度与大肠癌淋巴管密度虽无统计学差异，但随着肿瘤分化程度的降低，L M V D
14、 也逐渐增加，所以低分化肿瘤可能比高分化肿瘤具有更强的转移潜能。综上所述，我们认为在人类大肠癌中存在着淋巴管新生，肿瘤细胞可能自原发灶脱落下来进入扩张的淋巴管形成淋巴结转移，大肠癌L M V D 与淋巴结转移密切相关。2V E G F D 表达与大肠癌组织微淋巴管密度( L M V D ) 和淋巴结转移的关系在大肠癌内部及周边部有新生的淋巴管，并且证实L M V D 与淋巴结转移有关。有关淋巴管形成机制的研究发现，V E G F C 和V E G F D 是目前已知的促淋巴管生长因子，两者均属生长因子V E G F 家族成员。两者在结构上不同于血管新生因子V E G F ，因为它们虽含有氨基和
15、羧基末端水解前肽，但却保留了所有V E G F 家族成员的核心区，该区包含有胱氨酸序列。其中V E G F C 较为重要，所以许多学者致力于研究V E G F C 表达的临床意义。目前有关于V E G F D 参与淋巴管形成在人类肿瘤中表达的相关报告还较少。l9 9 8 年A c h e n 1 9 1 发现了V E G F 。D ，人V E G F D 基因位于染色体xP2 2 3 1 ，编码产物为3 5 4 个氨基酸的多肽【2 5 1 ，与研究论文V E G F C 的氨基酸序列有4 8 的同源性，与V E G F l 6 5 的氨基酸序列有3 1 的同源性。人V E G F C 、V E
16、 G F D 在胚胎发育早期的血管形成过程中起重要调控作用，在胚胎期血管以V E G F C 、V E G F D 表达为主，而成人期V E G F C 、V E G F D 仅特异性定位于淋巴管内皮细胞，血管内皮细胞仅表达V E G F 。有研究表明V E G F D m R N A 在胎心、肺、骨骼肌等脏器中高表达 2 4 1 ，二者都可与主要表达于淋巴管内皮细胞的受体V E G F R 3 ( flt4 ) 结合，诱导V E G F R 3酪氨酸激酶磷酸化，促进淋巴管生成或扩张1 2 0 , 2 1 2 2 。V E G F 。D 有三个潜在的N 端连接的糖基化点，其中的两个位点( 1 5 51 5 7 个残基和8 61 8 7 个残基1 同样存在于V E G F 二C 中。在N 端还有一个高度疏水的区域，是典型的蛋白分泌信号序列。St a c k e r 2
