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1、 曲阜师范大学博士/硕士学位论文原创性说明 （在划“”） 本人郑重声明：此处所提交的博士 硕士 论文黑线仓鼠 OT/OTR的结构分析与差异表达研究，是本人在导师指导下，在曲阜师范大学攻读博士 硕士学位期间独立进行研究工作所取得的成果。论文中除注明部分外不包含他人已经发表或撰写的研究成果。对本文的研究工作做出重要贡献的个人和集体，均已在文中已明确的方式注明。本声明的法律结果将完全由本人承担。 作者签名： 日期： 曲阜师范大学博士/硕士学位论文使用授权书 （在划“”） 黑线仓鼠 OT/OTR 的结构分析与差异表达研究 系本人在曲阜师范大学攻读博士 硕士学位期间，在导师指导下完成的博士 硕士学位论文
2、。本论文的研究成果归曲阜师范大学所有，本论文的研究内容不得以其他单位的名义发表。本人完全了解曲阜师范大学关于保存、使用学位论文的规定，同意学校保留并向有关部门送交论文的复印件和电子版本，允许论文被查阅和借阅。本人授权曲阜师范大学，可以采用影印或其他复制手段保存论文，可以公开发表论文的全部或部分内容。 作者签名： 日期： 导师签名： 日期： 曲阜师范大学 2009 级硕士毕业论文 I 摘摘 要要 黑线仓鼠（Cricetulus barabensis）是华北地区农业害鼠的优势种，其高繁殖力是影响其种群数量的主要原因之一，因此研究黑线仓鼠的繁殖机制显得尤为重要。本文从繁殖相关基因入手，从分子水平上揭
3、示害鼠种群数量波动机制，对鼠害的综合防控提供新的思路。催产素基因（Oxytocin，OT/Oxt）是与动物繁殖行为密切相关的基因，催产素通过与催产素受体（Oxytocin Recepter，OTR）的结合，不仅与分娩、射乳有关，还影响着动物的择偶、攻击等多种行为。本研究通过分析黑线仓鼠 OT 及 OTR 的 cDNA 序列，预测蛋白质的分子结构，并分别检测两者在不同发育阶段和不同组织器官中的表达情况，预测催产素在黑线仓鼠生长、发育以及繁殖过程中所起的作用，从而从分子生物学角度寻找控制黑线仓鼠数量及其危害性的有效方法。 本研究以山东省曲阜市吴村镇和沂南县蒲汪镇的农田里捕得的黑线仓鼠为研究对象，用
4、 RT-PCR 方法分别克隆 OT 和 OTR 的部分 cDNA 序列。其中，OT cDNA 序列 314bp，GenBank 登录号：JQ416144；OTR cDNA 序列 442bp，GenBank 登录号：JN180665。采用分子生物学软件对两者的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析，并预测其蛋白质二级、三级结构。研究结果表明：OT 编码区的 C-Y-I-Q-N-C-P-L-G 9 个氨基酸残基构成成熟的 OT 分子，第一位和第六位的两个 Cys 之间形成一个二硫键，这 9 个氨基酸残基之后的部分则形成 OT 的运载蛋白，其二级结构中含有较多的 转角，同时应用 SWISS-MODEL 蛋白
5、质同源模建服务器预测得到了 OT 运载蛋白的部分三级结构。OTR 的这部分序列包含完整的OTR 的 7 个跨膜螺旋中的第 2、3、4 跨膜螺旋和第 5 跨膜螺旋的一部分，推测第 2 跨膜螺旋之前的一个胞膜外结构域与 OT 羧基端的结合有关，后一个胞膜外结构域与 OT 环状结构的识别有关，第 3 和 4 跨膜螺旋结构参与 OT 分子识别的过程。此外这部分序列中有一个潜在的磷酸化位点和一个潜在的二硫键， 4 个连续的 L 结构在稳定蛋白质三维结构过程中起着重要的作用。用 SWISS-MODEL 蛋白质同源模建服务器预测分别得到了其 5787位和 1147 位氨基酸的三级结构。 使用 DNAMAN
6、分别将黑线仓鼠 OT 和 OTR 的 cDNA 序列与大鼠、小鼠、人等几个物种的相应 cDNA 序列进行同源性对比分析，发现黑线仓鼠与草原田鼠（Microtus ochrogaster） 、金仓鼠（Mesocricetus auratus）亲缘关系最近，与大鼠、小鼠较近，与偶蹄目和灵长目的几个物种亲缘关系均较远。 随后，本研究还采用实时荧光定量 PCR 方法分别比较 OT 和 OTR 在雌雄黑线仓鼠亚成年期、 成年发情期以及老年期三个发育时期以及脑、 心脏以及生殖器官中的相对表达量。结果发现：OT 主要在脑中表达，OTR 则主要在外周器官表达，因此认为 OT 虽然主要在脑中产生，但发挥生理作用
7、的部位主要在外周器官，这与经典的 OT 神经内分泌调控机制相一致。在发情期，OT 在脑和卵巢中表达均较高，提示了 OT 对动物发情行为具有一定影响。在雌性个体的生殖器官中，尤其是子宫中，OT 的表达量在成年发情期和老年期远远高于亚成年期，间接说明在亚成年期子宫发育尚未完全，结果提示，测定蛋白类激素基因曲阜师范大学 2009 级硕士毕业论文 II 表达量的方法有助于确定雌性黑线仓鼠与发情、生殖有关的发育状态。另外，发现 OT 和OTR 在亚成年期个体心脏中均具有较高的表达量，推测 OT 对黑线仓鼠心脏发育及其功能发挥有重要的调节作用，其具体作用机制还需进一步深入的研究。从整体来看，器官差异产生的
8、 OTR 表达量的差别大于发育时期不同产生的表达量的差别，但是对于 OT，在特殊器官和特定发育时期，其表达量的变化都比较明显。 总之，研究 OT 对动物行为的调节不能孤立地研究 OT 的分子结构及其表达量的变化，应结合与其密切相关的受体 OTR 以及其他一些相关基因综合来研究。 关键词关键词：黑线仓鼠；催产素；催产素受体；mRNA 差异表达 曲阜师范大学 2009 级硕士毕业论文 III Abstract Striped hamster （Cricetulus barabensis） becomes one of the dominant species that threatened the
9、 production and living of human as its high reproduction and the ability to adapt to environment,so it is important to study the genes that may influence its reproduction. Oxytocin(OT) is known as the gene which has close relationship with reproduction ,it is not only associated with delivery and mi
10、lk ejection but also affects the spouse selection and aggressive behaviour.Besides, oxytocin must bind to its receptor(OTR) and then could play its roles.Therefore,cDNA of OT and OTR in Cricetulus barabensis were cloned and analyzed in this study to forecast the molecular structures of OT and OTR,an
11、d then expression of OT and OTR in different developmental stages and tissues for Cricetulus barabensis were compared to forecast the functions that OT expressed in growth,development and reproduction for Cricetulus barabensis.In these ways,the effective methods from the biological point of views co
12、uld be found to control the population and harmfulness of Cricetulus barabensis. In this research,the Cricetulus barabensis captured in the Wucun of Qufu and Yinan of Linyi in Shandong Province were used to clone the cDNA of OT and OTR by RT-PCR technique,as a result,314bp of OT (GenBank accession:
13、JQ416144)and 442bp of OTR (GenBank accession: JN180665) was obtained.A variety of molecular biology software were used to forecast and analyze the second structures and tertiary structures of the two proteins. C-Y-I-Q-N-C-P-L-G in coding regions of OT constitute the matured OT,a disulfide linkage is
14、 formulated between the two Cys that located in the first and sixth site,the amino acid residues after the nine develop into transporting protein.Then, tertiary structure of transporting protein was forecasting by using the protein homology modeling server which is called SWISS-MODEL.As for OTR,the
15、sequences contain the second,the third,the forth and a part of the fifth transmembrane helix. We inferred that the extracellular domain before the second transmembrane helix was associated with the binding to C-terminus of OT,the latter extracellular domain was contributed to recognizing about annulation of OT,the third and the forth transmembrane helix may also participated in the process of recognizing.Besides,a potential phosphorylation site and a disulfide linkage were found in this sequence,the four successive L played an important role in stablil
