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1、 天然产物研究与开发 Vo1. 14 No.3NATURAL PRODUCT RESEARCH AND DEVELOPMENT 收稿日期: 2001 -08 -06 修回日期: 2001 -10 -16鉴定天然产物结构的利器 ) DEPT 和各种 2D NMR 谱肖定军( 中国科学院广州化学研究所 广州 510650)摘 要 本文概括性地介绍了 DEPT 技术和新近各种常用的二维核磁共振谱在天然产物结构鉴定中的应用以及相应的一些注意点。 关键词 天然产物; 结构鉴定; DEPT; 二维核磁共振谱自从 1946 年美国斯坦福大学的 F. Bloch 和哈 佛大学的 E. M. Purcell 两
2、个研究组首次独立观察到 核磁共振信号以来, 核磁共振谱学便迅速发展成为 化学家、 生物化学家、 物理学家以及医学家的不可缺少的物理方法。1971 年, J. Jeener 进一步提出了二 维核磁共振( two -dimensional NMR) 的概念, 但当时 没有引起科学界的足够重视。所以在 1980年以前, 核磁共振谱主要采用一维谱图, 即只有一个频率坐 标, 而第二坐标为信号强度。20 世纪 80 年代以后, 随着超导 FT -NMR 的问世及各种 NMR 软件的开 发利用, 二维傅立叶变换核磁共振技术得到了快速发展, 以致现在成了鉴定复杂天然产物结构必备的 有力武器。它的二个坐标轴皆
3、为频率坐标, 而信号 强度出现在第三维空间。二维核磁共振谱的发明是 核磁共振技术划时代的发展, 是近代波谱学最重要 的里程碑。过去鉴定一个天然产物的结构往往需要 几年甚至好几十年的时间, 而现在有了各种先进的 2D NMR技术, 使一些复杂结构的鉴定工作只需几 周或几天即可完成。在二维核磁共振谱和脉冲 -傅立叶变换核磁共振方面作出突出贡献的瑞士核磁共 振谱学家 R. R. Ernst 因此荣获了 1991 年的诺贝尔 化学奖, 这也进一步说明了二维核磁共振谱的重要 性。近几年又发展成功了三维或多维核磁共振谱, 它们是二维谱的延伸, 在对蛋白质分子氨基酸残基 序列的指认上具有不可替代的优势, 但
4、从鉴定一般 有机化合物的结构来看, 二维谱核磁共振谱已能完全满足需要1 4。 二维核磁共振谱分 J 分辨谱、 化学位移相关谱 和多量子谱三大类。在实际应用上, 化学位称相关 谱( D -D谱) 最为重要, 它是二维核磁共振谱的核心 3, 也是下面重点介绍的对象。本文就 DEPT 技 术和新近各种常用的二维核磁共振谱在天然产物结 构鉴定中的应用心得和一些注意点作一个概括性的 介绍, 期望能给广大结构测定工作者带来一些启迪 和帮助。1 DEPT 和各类型的二维谱111 DEPT 谱DEPT 是无畸变极化转移增益法( Distortionless Enhancement by Polarizatio
5、n Transfer) 的简称。此 法主要用于碳原子级数的确定。它是通过改变照 射1H 的第三脉冲宽度( H ) , 使作 45b、 90b和 135b变化 而得出的13C NMR 谱。实际应用中仅测 DEPT90 和 DEPT135 即可。因为 H = 90b时, 只有 CH 出峰; 而H = 135b时, CH3、 CH 向上出峰, CH2则向下出峰, 由此 即可将全去耦碳谱中各个碳原子的级数确定 下来。虽然 APT 和 INEPT 技术也有类似的作用, 但都存在着一定的缺陷, 所以一般情况下, 最常采用 DEPT 法来确定碳原子的级数。有时 DEPT 的结果 对确定或佐证化合物的分子式也
6、能起到相当大的帮 助。可以这么说, 在推导未知天然产物结构的过程 中, DEPT 谱起着桥头堡的作用。 112 同核位移相关谱11211 COSY 它是二维谱中最容易测定的一种, 最为人们所熟知。在原理上是所有二维谱的基础。 它的 X1( 纵轴) 和 X2( 横轴) 方向的投影均为所测化 合物的一维氢谱。该谱的目的是准确找出分子内各 个自旋体系中质子间的耦合关系, 进而得到化合物 的一些结构片段。谱中的交叉峰或相关峰反映了两 个峰组间的耦合关系。从某一相关峰出发, 按一定 程序进行一一追踪, 即可得出化合物的某个结构片 段。解谱时要留意远程耦合交叉峰, 将它与3J 耦合 相关峰区分开。一般情况
7、下, 远程耦合( J = 1 2)75的交叉峰横截面较3J 耦合小。有时为了观察幅宽而不锐的信号的弱相关峰, 需降低等高线的水平另 作一张 COSY 谱; 有时还可根据目的和要求的不 同, 做到从重叠的信号群中只取出其中一个质子的信号( 化学位移) 作断面图进行观察, 以发现一些额 外的耦合关系或准确识别一些相关峰的裂分峰型。 11212 GCOSY 在 COSY 脉冲序列的基础上再结 合脉冲场梯度技术, 即可得 GCOSY, 外观与 COSY一样, 但溶剂峰得到抑制, 且信噪比 S/ N( signa- l to - noise ratio) 有很大提高。 11213 Phase Sensi
8、tive COSY( 相敏 COSY) 目的和作用与 COSY 类似, 但该谱的交叉峰已调为纯吸 收线型, 故分辨率比 COSY 大为改善, 能分辨正负 吸收峰( 相应于空心点和实心点) , 所以从谱峰的精细结构能较容易地读出耦合常数 J, 谱图的信噪比 也有一定的提高。其他类型的二维谱也可作自己的 相敏方式。11214 COSY-45( B -COSY) 即第二个脉冲为 45b 的COSY 谱, 能直观辨认2J 和3J 耦合关系, 且对角 线峰沿对角线方向变细, 有利于发现强耦合体系( D较近的峰组) 之间的相关峰。谱图上的交叉峰表现 为斜四方形, 偕耦关系的交叉峰为右上斜四方形, 邻 耦关
9、系的交叉峰则为左上斜四方形。11215 Constant T ime COSY( 常时 COSY) 即 X1 方向全部去耦的 COSY 谱, 其纵轴方向的投影为去 耦氢谱, 质子信号全呈一个个孤立单峰( 类似碳谱棒图) , 因此谱图中的交叉峰便呈现条形水平状。这样 就大大增加了 X1维方向的分辨率, 极大地方便了对谱图中严重重叠部分的解析工作。 11216 LRCOSY 能反映远程耦合关系( E4J ) 及弱的3J 耦合关系的 COSY 谱, 而反映2J、3J 耦合的交叉峰的强度则因弛豫有所减弱 3。LRCOSY 也称 COSYLR。 11217 DCOSY 能突出反映烯丙耦合、 高烯丙耦 合
10、及 W 型耦合等各种远程耦合的 COSY 谱, 而由2J、3J 耦合引起的相关峰几乎全部消失 5。 11218 DQF -COSY 双量子滤波二维谱, 外观与相敏COSY 基本相同, 优点是: 抑制了溶剂峰和某 些化合物所固有的强峰( 如含叔丁基, 甲氧基) 交 叉峰和对角线峰均调为吸收型, 峰型有极大改善, 对角线旁的交叉峰不受干扰或干扰很小。和以上各 COSY 谱相比, DQF -COSY 谱的信息更可靠, 分辨 率最高, 因此近来在天然产物的结构鉴定工作中, DQF -COSY 的应用频率要远远高于其他各类型的同核 COSY 谱。11219 TOCSY( 总 相关谱 total corr
11、elation spec - troscopy) 一种测定分子中所有耦合氢关系的二维 化学位移相关谱。从任一谱峰出发, 可以找到好几个相关峰, 它们表示与该氢核均处于同一个自旋体 系中6,7。由于存在远程耦合关系的质子都是处在 同一个自旋体系中, 所以 TOCSY 的出现使反映远程耦合关系的 LRCOSY 谱或 DCOSY 谱的地位大 大下降。近来在一些复杂天然产物结构的鉴定工作 中, TOCSY 成了必不可缺的一项实验。112110 HOHAHA ( 同核 全相关 谱 homonuclear Hartmann -Hahn spectroscopy) 与 TOCSY 类似, 是 测定分子中所有
12、相互耦合氢关联的化学位移相关谱。两者的脉冲序列不同, 但结构是一样的, 外观也 完全相同。所以 HOHAHA 也经常用于复杂分子的 结构测定工作中。113 NOE 类相关谱 11311 NOESY( 二维核欧活豪斯效应谱 two -d- imentional Nuclear Overhauser Effect correlation spec - troscopy) 研究分子中核 Overhauser 效应的二维谱方法。外观与普通 COSY 类似, 但对角线两边的交 叉峰不是表示通过化学键的相互耦合关系而是 NOE 关系, 显示在空间距离上两者相近。一般来说,在 200 400 Da 的分子中
13、, 质子间距离小于 0127 nm 的 大 多 有 NOE 效 应。要注 意 的 是, NOESY 谱中往往残留一些 H -HCOSY 谱的信息。 因此, 在进行 NOESY 谱测量之前, 最好先测 COSY谱, 二者相比较则可得到较精确的 NOE 结果。另 外, 有时作 NOESY 时, 为进一步确认一些弱的 NOE 相关, 需多作几张等高线图, 或利用多个断面图来识别。由于 NOESY 对确定有机化合物结构、 构型和构象的巨大作用及对生物分子能提供重要信 息( 如确定蛋白质分子在溶液中的二级结构) 2, 故NOESY 在二维谱中占有非常重要的地位, 近几年 被越来越频繁地使用着。11312
14、 ROESY( 旋转坐标系欧沃豪斯增益谱 Ro - tating frame Overhauser Enhancement spectroscopy)一种相敏的测定分子中 NOE 关系的二维谱方法, 弥补了在某种情况下 NOESY 得不到交叉峰的 缺陷。与 NOESY 相比, ROESY 中不会出现相关峰 强度为零的情况。它主要适用于检测中等大小分子内的 NOE 关系6, 在实际鉴定工作中的应用也非 常多。 11313 HOESY 异核的 NOE 谱, 外观与 HC -76 天然产物研究与开发Vo1. 14 No. 3COSY 相似, 差别在于后者的交叉峰反映的是1JC -H关系, 而 HOE
15、SY 的交叉峰反映的是13C 和1H 的 NOE 关系, 即它们在空间的距离是相近的。 114 异核位移相关谱11411 HC -COSY 检测13C 的异核位移相关谱。 它能测定分子中碳氢的直接相连关系。谱图 X1方 向投影为氢谱, X2方向投影为全去耦碳谱。交叉峰反映1JC -H关系。由于是对13C 进行采样, 实验时须 投放较多样品, 累加时间较长。解谱时, 作断面图则对重叠部分信号的归属有较大帮助。 11412 COLOC ( 异 核远程 相关 谱 heteronuclear shift correlation via long range coupling) 测定分子 中远程( 通常
16、为三键内) 氢碳相关的方法。其作用和 HMBC 类似, 对含季碳较多的化合物的谱峰归属和 指认特别有效 7。由于是对13C 进行采样检测, 灵敏度差, 而且可靠性不够, 不如 HMBC 常用4。解 谱时要注意1JCH引起的相关峰有时也会在 COLOC 中出现。 11413 HMQC( 检测1H 的异核多量子相关谱1H - detected heteronuclear multiple -quantum coherence)作用相当于 HC -COSY, 但它的 X1方向投影为全 去耦碳谱, X2方向投影为氢谱, 与 HC -COSY 恰相反。由于是对1H 检测, 信噪 比值( S/ N) 比 HC - COSY 提高 8 倍, 大大减少了样品的用量和累加时 间, 由于二维谱 X1方向的分辨率比 X2差很多, 所以X1维(D c) 分辨率差是 HMQC 的较大缺点。因此,若样品量较多时宜作 HC -COSY 谱。另外, X1方向有时会显示1H,1H 耦合
