透明质酸及其发酵概述

《透明质酸及其发酵概述》由会员分享，可在线阅读，更多相关《透明质酸及其发酵概述（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、透明质酸及其发酵生产概述透明质酸及其发酵生产概述 郭学平 王春喜 凌沛学 张天民 透明质酸(hyaluronic acid，HA)，又名玻璃酸，是一种酸性黏多糖，1934年美国 Meyer 等1首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。此后，人们对 HA 的分布、生理作用、化学结构、理化性质、制备工艺及其在医疗和化妆品方面的应用进行了广泛深入地研究。我国从 80 年代开始研究 HA 的分离纯化制备工艺25和临床应用，90 年代初已有 HA 制剂作为新药上市6，生产方法由提取法发展到微生物发酵法7。 1 自然存在及生理作用自然存在及生理作用 HA 广泛存在于动物的各种组织细胞间质中，如皮肤、脐带、关节滑液

2、、软骨、眼玻璃体、鸡冠、鸡胚、卵细胞、血管壁等其中以人脐带、公鸡冠、关节滑液和眼玻璃体含量较高早期 HA 主要从人脐带和鸡冠中提取制备。HA 是链球菌、绿脓杆菌等类的菌株荚膜中的主要成分，这就是发酵法生产HA 的微生物学基础。 在不同组织中 HA 的生理作用也有所不同：在皮肤中主要表现为保水作用，在关节滑液中主要为润滑作用;在血管壁中主要是调节通透性。另外 HA作为聚阴离子电解质，分子上所带的大量负电荷，可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的活性。 2 化学结构及理化性质化学结构及理化性质 HA 是由(13)- 2- 乙酰氨基- 2- 脱氧- - D- 葡萄糖- (14)- O- - D- 葡

3、糖醛酸双糖重复单位所组成的直链多聚糖，见图 1。HA 的结构非常规则，相同的双糖单位为 HA 的基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的 HA 无种属差异。PDF created with pdfFactory trial version 对人类及动物无抗原性。HA 分子链的长度及分子量是不均一的分子量范围为 210570106，双糖单位数为 30011000 对，属于生物大分子。商品 HA一般为钠盐形式为白色纤维状或粉末状固体，有较强的吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂，医用级分子量为 1010525106，化妆品级为 51051.5106。 图 1 HA 的化学结构 HA 水溶液最突出的特点是高

4、黏度，这是由其结构所决定的：一是具有很长的线性分子链；再是分子链上等距离的葡糖醛酸上的羧基所带的负电荷相互排斥，使分子接呈伸展状态，占据较大的空间，而不卷缩成一团。即使在较低浓度下，分子间也有强烈的相互作用，因此具有很高的黏度，同时具有很好的润滑作用。HA 在水溶液中分子链之间形成疏松的网状结构，能够结合保持大量的水，即具有较强的保水作用。HA 在临床和化妆护肤方面的应用正是基于其高黏度和保水性质。 阳离子可降低 HA 溶液的黏度，离子强度越高，黏度下降越多，二价阳离子的作用大于一价阳离子。 某些三价阳离子， 如 Fe3+可使 HA 分子间发生交联，其溶液呈凝胶状，黏度大大增加。多种物理和化学

5、因素如酸碱性、温度、透明质酸酶、紫外线、射线等，可使 HA 大分子降解，导致黏度下降。在HA 及其制剂的生产中，应尽量减少分子链的降解，保持其大分子特性。 PDF created with pdfFactory trial version 3 HA 的生产方法的生产方法 HA 最初是从公鸡冠、人脐带、动物眼球中提取的，这些动物原料的数量有限，成本较高。随着 HA 的应用范围不断扩大，提取法生产的 HA 已不能满足医药和化妆品生产的需要。为了寻找 HA 的新来源，降低生产成本，研究了发酵法生产 HA8。 早在 1937 年，Kendall 等9就发现链球菌可产生 HA，许多人对此进行了研究。结果

6、表明，链球菌属的多种细茵都有荚膜，这种荚膜的主要成分就是HA。链球菌在生长过程中荚膜的产生有几种不同的情况，有的菌株在整个生长期都有荚膜，有的在对数生长期的前段产生、后段消失，有的根本不产荚膜。进一步的研究发现这与所用的菌种是否产生透明质酸酶有关，荚膜的消失是由于被酶解了。透明质酸酶的产生对 HA 的发酵是非常不利的。有观点认为有荚膜的链球菌就不产透明质酸酶，产透明质酸酶的菌种就不产荚膜；也有研究发现产荚膜的链球菌也产生透明质酸酶，荚膜的有无是 HA 生物合成与酶解的动态平衡的结果10。 早期对链球菌产生 HA 的研究，是为了说明链球菌的这一特性以及由 HA组成的荚膜的作用等， 而不是以发酵生

7、产 HA 为目的， 收率在每升培养液 0.6g以下。工业化生产水平的 HA 发酵是日本资生堂开始研究的，他们借鉴前人对某些链球菌产生 HA 这一重要发现，利用现代发酵技术和设备，以提高 HA产率为目的，对发酵生产 HA 进行了较全面地研究。之后日本的许多公司和研究机构相继开展 HA 发酵研究， HA 的发酵水平从 24g/L， 提高到 67g/L。80 年代中期，日本已有发酵生产的 HA 上市，价格大大低于从动物原料提取的产品。提取法和发酵法生产 HA 的比较见表 1。发酵法生产 HA 比提取法有PDF created with pdfFactory trial version 较大优势。这方

8、面的研究主要集中在日本，英国和美国也有少量报道。本所是国内最早从事 HA 发酵研究的，从 90 年代初开始，先后完成了小试7和中试实验11，并已投入生产。 表表 1 提取法和发酵法生产提取法和发酵法生产 HA 的比较的比较12 项目 提取法 发酵法 存在状态 在原料中与蛋白质和其它多糖形成复合体,分离精制复杂 在发酵液中游离存在， 分离精制容易 分子量与保湿性 小于 10105，保湿性差 大于 15105，保湿性强 品质与产量 取决于动物原料的品质与数量 品质稳定，产量大 价格 100 万日元/kg 5060 万日元/kg 应用 价格昂贵， 化妆品中的添加量受到制约 能增加化妆品中的添加量 目

9、前所用的菌种是链球菌属的 A 群和 C 群。A 群主要是酿脓链球菌等，但由于 A 群致病性较强，较少使用。C 群致病性较弱，多采用此类茵，主要有兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等。菌种从保藏机构获得或从动物的鼻黏膜或眼结膜分离得到，这些现有的菌种大多数都产透明质酸酶，HA 发酵产率低。发酵产率较高的菌种一般是经诱变得到。诱变的方法为紫外线照射或诱变剂处理。 日本专利13报道了一种用 NTG(- 甲基- 硝基- 亚硝基胍)诱变的方法：原始菌种是从牛鼻黏膜分离得到的，经鉴定为兽疫链球菌，为溶血型，产 HA 也产透明质酸酶。为了克服原菌种的不利因素，进行了两步诱变，第一步用 NTG 处理后，接种于血

10、琼脂培养基上进行培养，收集无溶血环的菌落，得到不产生溶血素的变种；对此再进行第二步 NTG 处理，分离鉴别得到不产生透明质酸酶的变种。此诱变菌种在发酵过程中 HA 只合PDF created with pdfFactory trial version 成不酶解， 可在发酵液中不断积累， 发酵产率高达 6.7L， 分于量2105，未经诱变的原菌种发酵产率仅为 2L，分子量为 31056105。两步处理的诱变率分别为 410- 6和 510- 5， 即从几十万甚至上百万个细菌中才能得到一个所需的变种，工作量之大是可想而知的。 链球菌的营养要求较高， 一般资料介绍说在加血液或血清的培养基上才能生长，

11、这对于工业化生产来说成本太高。目前专利文献中所介绍的菌种，其发酵液中均未加血清。所用的氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。其中酵母膏最常用，它除了作氮源外还含有多种维生素，有些是菌种生长所必须的。在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可以提高 HA 的产率14,15。碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，也有用玉米浆的，它既是碳源也是氮源。最常用的是葡萄糖。其它还有磷酸盐、硫酸盐，钾、钠、钙、镁等无机盐，铁、锰、铜、锌等微量元素。 HA 的发酵有需氧发酵也有厌氧发酵。通气对于链球菌产生 HA 的作用尚有争论。Cleary 等16发现，通气刺激链球菌产生

12、HA 荚膜，形成一个隔氧的屏障，阻止分子氧对菌体的毒害作用。但在厌氧条件下链球菌也产生 HA，Bracket 等17 指出，通二氧化碳的厌氧发酵，可将 HA 的收率提高到 2gL以上。目前看来多倾向于有氧发酵，专利文献中 HA 产率较高的多采用通气需氧发酵，而且分子量高。厌氧发酵产率低，分子量也低。在整个发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，而在不同的阶段采用不同的溶氧量，也是提高 HA 产率的手段之一。 在 HA 的发酵生产中，pH 值是一个重要的因素，一股控制在 6.08.5 范PDF created with pdfFactory trial version 围内，低于 6.0 或高于 8

13、.5，会影响菌体的生长，降低 HA 的产率和分子量18。在发酵过程中， 菌体会产生乳酸和醋酸等小分子有机酸， 使发酵液 pH 值降低。需要用氢氧化钠或碳酸钠溶液进行中和，以维持适当的 pH 值。HA 的发酵温度通常为 37、 也有的采用 35或 33等较低的温度， 这需视具体菌种而言。 HA发酵的一船工艺流程为： 试管菌种接入三角摇瓶中37振荡培养1218h，接入已灭菌的种子罐中，接种比例为 1：200 左右，培养 l218h，镜检菌体生长良好，无杂菌后接入已灭菌的发酵罐中，接种比例为 1：10 左右。发酵过程中，需要检测的参数主要有 pH 值、溶氧量、葡萄糖含量、发酵液黏度、HA 含量和菌体

14、密度等。菌体在发酵时不断向发酵液分泌 HA，随着 HA在发酵液中累积，发酵液的黏度逐渐增高，测定发酵液黏度可直观地反映出HA 产率的高低。菌体密度以 OD660（660 nm 处的光吸收度)或单位体积发酵液中的菌体湿重来表示。值得注意的是，对于同一菌种，在不同的发酵条件下，菌体密度高，HA 的产率不一定高，这说明细菌在某种条件下主要进行菌体增殖，HA 作为次级代谢物的产生减少了，它不是构建菌体所必需的物质。检测葡萄糖含量，是观察菌体对糖的利用情况，必要时可在发酵过程中补充一定量的葡萄糖，葡萄糖含量降到接近零时为发酵终点。 发酵液中 HA 在菌体外的溶液中游离存在，与从动物组织提取相比，无需提取

15、步骤，易于分离纯化。首先要杀灭和除去发酵液中的菌体，通常加入杀菌剂或加热灭活菌体后离心或过滤除茵。HA 含量较高时，发酵液黏度很高需要用水稀释后再离心或过滤除菌体，滤液再经乙醇沉淀、氯代十六烷基砒啶（CPC）沉淀、超滤等方法进行分离纯化，最后用有机溶剂沉淀、真空干燥制得最终产品，为白色纤维状或粉末状。 PDF created with pdfFactory trial version 乙醇沉淀步骤在 HA 的分离纯化中占有重要地位， 往往需要重复进行 24 次。用乙醇沉淀 HA 时，HA 溶液中一定要有盐的存在，否则不产生沉淀，这是酸性黏多糖的共性。常用的盐为 NaCl 和 NaAc，浓度在 1左右即可。乙醇沉淀 HA，可除去不能沉淀的杂质，还有一个重要的作用是脱色，经多次乙醇沉淀后，HA 为纯白色。 发酵生产 HA 具有产量不受原料资源限制、成本低、分离纯化工艺简捷、易于规模化生产等特点，是 HA 生产的发展方向，应进一步深入研究和提高。 参考文献参考文献 1 Meyer K, Palmer JW J Biol Chem, 1934, 107: 629 2 张天民，凌沛学，沈渤江，等生化药物杂志，1985， （2） ：23 3 沈渤江，张天民山东医学院学报，1985，(4)：15 4 沈渤江，张天民医药工业，1986，(7)：291 5 凌沛学，张天民，张子刚医药工业，19