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1、离体兔主动脉环实验07 临床 曲宁一、目的 学习离体器官组织灌流的方法， 掌握兔主动脉环制备技术， 观察维拉帕米对 电压门控通道的阻断作用及酚妥拉明对配体门控钙通道的阻断作用。二、原理 高浓度的氯化钾液（ 60100mmo1 ）可使血管平滑肌细胞去极化，促使电压 门控钙通道开放，引起胞外Ca2+内流，导致血管平滑肌收缩。能阻断高钾液此作用的药物则为电压门控钙通道阻断药。 受体激动药（如苯肾上腺素）诱导血管收缩是由1 肾上腺素受体的激活 造成的，主要通过激活磷脂酶C，产生甘油二脂和三磷酸肌醇（IP3），主要由 IP3 诱导肌浆网内的Ca2+释放而致血管环（条）收缩，受体阻断药可阻断此作 用。当
2、NE 与血管平滑肌细胞 受体结合，可导致血管平滑肌收缩；与? 受体结 合则导致血管平滑肌舒张。NE 与 受体结合能力较与? 受体结合的能力强，故 NE 具有很强的血管收缩作用 逐步递增 受体激动药的浓度（累积浓度），引起血管环出现剂量依赖性收 缩（可根据剂量调整在一定范围提高疗效），记录药物量效曲线。然后给予 受体阻断药，再重复上述实验，可使该量效曲线平衡右移，但最大效应不变， 计算出 受体阻断药的拮抗参数（ pA2）以确定该阻断药的阻断效价 酚妥拉明 (Phentolamine)为短效 -受体阻滞剂，与去甲肾上腺素能神经递质 和拟肾上腺素药竞争-受体而发挥阻滞作用。对1和 2受体都有阻滞作用
3、， 能直接松弛动静脉平滑肌 维拉帕米为 Ca 离子通道阻滞剂，它在发挥作用前必须通过钙离子通道 进入细胞。所以它的作用是与钙离子通道活性直接相关的。维拉帕米作用 于开放状态的通道，具有频率依赖性和使用依赖性。三、材料 1 实验对象健康的兔子，雄性，体重250280 克； 2 实验器材麦氏浴槽，超级恒温水浴，温度计，5g 张力换能器，微 机生物信号采集处理仪，手术剪刀，眼科剪，眼科镊，培养皿，烧杯，100 l、 1m1 移液器，棉线； 3 实验药品3mo1/L 氯化钾， 10-5mo1/L 维拉帕米， 10-3mo1/L 肾上腺素，10g/L 酚妥拉明， 1mmol/L 乙酰胆碱， Krebs液
4、，95%O2+5%CO2混合气体 . 四、实验步骤 1、实验系统连接和仪器参数设置 （1） 实验装置连接按下图连接装置。将张力换能器固定于微距调节器上， 换能器输出线接微机生物信号处理系统输入通道。麦氏浴槽中充以 Krebs 台氏液 至固定水平面， 调节超级恒温器的温度至37，保证麦氏浴槽内 37 0.5 恒温，通气管接气瓶（ 95%O2+5%CO2）管道。调节通气管气流量，通气速度以麦氏浴 槽中的气泡一个个逸出为宜。 2、仪器参数设置 （1）RM640 系统仪器参数：张力换能器输入通道模式为张力，时间常数 为直流，滤波频率10Hz,灵敏度 3g，采样频率 100Hz,扫描速度 25s/div
5、. （2）PcLab和 MedLab 系统仪器参数：张力换能器输入通道信号名称为张 力，放大倍数 200500、直流耦合、上限频率10Hz,采样间隔 5ms.图 11-27-1 血管灌流示意图用 Krebs 液反复脱洗标本使其张力回复初始值，间隔 30 分钟进行下一项目， 每隔 15 分钟换液一次。 3、实验方法（1） 用钝器击晕兔子后， 剪开胸腔，迅速取出心脏及胸主动脉放入盛有4 的混合气体饱和的Krebs 营养液的培养皿中， 连续用混合气体充气。 分离出主动 脉，将血管内的残存血液冲洗干净，小心剥去外围的结缔组织， 将主动脉弓以下 的胸主动脉剪成 4mm 长的动脉环数段备用。 （2）需要保
6、存内皮的血管，动作应轻柔。如需无内皮的血管环，可用棉签 或牙签将血管内皮轻轻檫去。 （3）将血管环固定悬挂于盛有10ml Krebs 液的麦氏浴槽内，将固定杆上的 不锈钢钩轻轻穿入血管环一侧， 并将另一端连接有细线的系于张力换能器上，通 入混合气体，调节通气量至一个一个小气泡逸出为好。浴槽内温度应保持 37 0.5 。 （4）血管环的初始张力前15 分钟为 1.5g ，15 分钟后调至 2.4g，并以此张 力平衡 45 分钟。每隔 15 分钟换液一次。 （5）用终浓度 60mmol/L KCL （3mol/L KCL 200 l ）收缩血管环，待收缩稳 定后用预热的 Krebs 洗脱，反复冲洗
7、直至张力恢复到初始值为止；重复加入同一 浓度 KCL ，连续 3次，用 Krebs 液反复脱洗标本使其张力回复初始值。 （6）用 10-3mol/L 的肾上腺素 100 l（终浓度 10-6mol）诱发血管收缩达稳定 后，加入 10-3mol 的乙酰胆碱 100 l （终浓度 10-6M ），观察血管的松弛效应是否超过 10% ，如果 10% 则为内皮完整，否则为内皮受损或无内皮。( 血管内皮细胞 的完整对血管平滑肌舒宿起调节作用，但此实验可以用内皮完整型) 五、 观察项目 按以下顺序把药物加于浴槽中： 1 加入 3mo1 L 氯化钾 100 1，观察并记录动脉环的收缩。Krebs 液反复 脱
8、洗标本使其张力回复初始值。 2. 加入 10-5mo1 L 维拉帕米 200 1， 15min 后再加入 3mo1/L氯化钾 200 l 。 记录动脉环收缩，在收缩达高峰后用Krebs 液反复脱洗标本使其张力回复初始 值。 3. 加入 3mo1 L 氯化钾 100 1，待曲线上升期间迅速加入维拉帕米，观察 曲线变化情况。曲线平稳后用Krebs 液反复脱洗标本使其张力回复初始值。 4 加入 10-3mo1/L 肾上腺素 100 1，记录动脉环的收缩，在反应达高峰时用 Krebs 液反复脱洗标本使其张力回复初始值 5 20min 后，加入 10g/L 酚妥拉明 100 l ，10min 后再重复观
9、察项目 2，记 录动脉环的收缩。6 把主动脉环取出，用滤纸吸去其表面水分，称重。六、实验结果 记录测定每次加药前后血管环的张力， 计算出每次给药后每克动脉环收 缩张力，分析实验结果。 K+可以使血管平滑肌细胞去极化，促使电压门控钙通道开放，引起胞 外 Ca2+内流，导致血管平滑肌收缩。所以加入氯化钾时，张力曲线上升。维拉帕米可以阻断电压门控钙通道， 所以加入维拉帕米后再加入氯化钾曲线升高幅度降 低。而在加入氯化钾后在曲线上升时加入维拉帕米，则曲线应该迅速趋于平稳。 肾上腺素激动血管的 1 受体，使血管收缩，所以张力曲线上升，表明 在苯肾上腺素的作用下，主动脉环剧烈收缩。 酚妥拉明具有可以选择性
10、的与受体结合，从而竞争性的抑制了肾上腺 素与受体结合，使肾上腺素的作用减弱消失， 此时再加入肾上腺素则张力曲线 无变化。七、注意事项 1.Krebs 必须临用时用新鲜蒸馏水配制。 2.内皮细胞除分泌舒血管物质外，还分泌缩血管物质如ET1、Ang、 TXB2。可见内皮细胞对血管张力的调节具有收缩与舒张的双重作用。 3. 乙酰胆碱 (acetylcholine， Ach)引起的内皮依赖性舒张反应。 4. 营养液的配制、分离血管时营养液是否充分氧饱和并预冷，营养液 PH 值，剥离制备血管环方法是否未损伤血管内皮等因素都可已影响实验结果。 5.注意气泡均匀，保持一秒钟一个气泡为最佳。这样既可以满足需要， 又不会因为气体的逸出而导致液体的震动，从而影响到传导装置， 使曲线发生变 化八、参考文献 （1） 厉旭云：离体大鼠主动脉环实验，路源况炜 张红 主编机能学 实验教程，第一版，北京：科学出版社，2005 （2）消化道平滑肌的生理特性实验， 机能学实验指导，厦门大学医 学院， 2008年 4 月 （3）大鼠离体动脉环实验，浙江大学医学院生理学系 （4） 药理学杨宝峰主编 （5）海州香薷总黄酮对离体大鼠主动脉环张力的作用及机制徐佳 陈军津周育成 王会平 （6）白细胞介素 -2 引起离体大鼠主动脉环舒张及其作用机制曹春 梅叶松俞虎徐庆生叶治国沈岳良陆源夏强
