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1、 免疫组化结果的分析和判断第一节第一节 免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则免疫组化结果的判断原则概括起来有免疫组化结果的判断原则概括起来有以下几点：以下几点： 必须同时设对照染色必须同时设对照染色。没有对照染。没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的。色的免疫组化染色结果是不可信的。抗原表达必须在特定部位抗原表达必须在特定部位。如。如LCALCA应应定位在细胞膜上；定位在细胞膜上；CKCK应定位在细胞浆内；应定位在细胞浆内；PCNAPCNA及及p53p53蛋白应定位在细胞核内；蛋白应定位在细胞核内；EMAEMA应应定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在部定位在细胞膜上，等等。不在抗原所在
2、部位的阳性着色，一概不能视为阳性。位的阳性着色，一概不能视为阳性。阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。由由于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因于检测方法灵敏度有高低之分，有时可因染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，染色方法灵敏度不够，而导致阴性反应，判断时应注意。判断时应注意。 尽量避开出血、坏死及切片刀痕尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的阳性表达，和界面边缘细胞的阳性表达，特别是酶特别是酶免疫标记。因为这类阳性着色多系内源免疫标记。因为这类阳性着色多系内源干扰，或系人为因素所致。干扰，或系人为因素所致。对免疫组化标记结果的意义不能对免疫组化标记结果的意义不能绝对
3、化，绝对化，应结合临床资料、应结合临床资料、X X线等影像学线等影像学及实验结果综合分析。及实验结果综合分析。* * 第二节第二节 对照染色设计对照染色设计( (一）对照染色的目的一）对照染色的目的设对照的目的是为了排除假阴性和设对照的目的是为了排除假阴性和假阳性。假阴性的原因主要有三：假阳性。假阴性的原因主要有三：组织组织处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；处理不当，抗原丢失过多或被遮蔽；抗抗体失活、效价过低或稀释度不合适（主要体失活、效价过低或稀释度不合适（主要指一抗，即特异性抗体）；指一抗，即特异性抗体）；染色步骤遗染色步骤遗漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液的漏及差错，或显色剂的选择、缓冲液
4、的pHpH 和离子强度不当等。和离子强度不当等。 假阳性均系由多种因素造成的非特异假阳性均系由多种因素造成的非特异着色所致，原因主要有：着色所致，原因主要有：自发荧光或内自发荧光或内源酶等干扰；源酶等干扰；抗体试剂不纯抗体试剂不纯( (特别是一特别是一抗）；抗）；操作失误，如污染、切片干枯或操作失误，如污染、切片干枯或显色剂操作不当等；显色剂操作不当等；FcFc受体的干扰，等受体的干扰，等等。等。（二）对照的种类及其选用目的（二）对照的种类及其选用目的 对照染色大致可分为：对照染色大致可分为：阳性组织对照、阴性组织对照及阴性试剂对照和自身对照四大类：阳性组织对照阳性组织对照 指用已证实含有靶抗
5、原指用已证实含有靶抗原的同源及不同源组织切片或细胞涂片与的同源及不同源组织切片或细胞涂片与待检实验切片同时作同样处理和免疫染待检实验切片同时作同样处理和免疫染色的组织对照。正确的结果应呈现阳性色的组织对照。正确的结果应呈现阳性，目的是为了证实所用免疫组化染色流，目的是为了证实所用免疫组化染色流程的有效性，排除假阴性的可能。程的有效性，排除假阴性的可能。 阴性组织对照阴性组织对照 指用已证实不指用已证实不含靶抗原的同步处理和免疫标记染含靶抗原的同步处理和免疫标记染色的组织对照。正确的结果应为阴色的组织对照。正确的结果应为阴性，目的是除外假阳性。性，目的是除外假阳性。阴性试剂对照阴性试剂对照 是指
6、用于证实在免疫是指用于证实在免疫组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗组化染色中所用试剂，尤其是特异性抗体试剂的有效性和可靠性而所设立的同体试剂的有效性和可靠性而所设立的同步免疫染色对照，包括有：步免疫染色对照，包括有：空白对照；空白对照；替代对照；吸收试验和抑制试验替代对照；吸收试验和抑制试验等。目等。目的在于除外假阳性和证实所用免疫组化的在于除外假阳性和证实所用免疫组化试剂及其技术方法的有效性和待检实验试剂及其技术方法的有效性和待检实验切片免疫标记阳性结果的可靠性。切片免疫标记阳性结果的可靠性。空白对照空白对照 指以缓冲液（指以缓冲液（PBSPBS、TBSTBS等）取代第一抗体（主要的，必要时
7、还等）取代第一抗体（主要的，必要时还可做第二抗体及桥联抗体的空白取代）可做第二抗体及桥联抗体的空白取代），其他各步不变的试剂对照染色，结果，其他各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性。应为阴性。 取代对照取代对照 指以所用方法第一抗体同源动指以所用方法第一抗体同源动物的正常血清，或与本实验无关的抗体物的正常血清，或与本实验无关的抗体( (靶靶生物缺如的生物缺如的) )取代第一抗体，其他步骤不变取代第一抗体，其他步骤不变的试剂对照染色，结果应为阴性。的试剂对照染色，结果应为阴性。吸收试验吸收试验 是指用事先经过量抗原吸收的是指用事先经过量抗原吸收的第一抗体上清液取代第一抗体，其他步骤不第一抗体上清
8、液取代第一抗体，其他步骤不变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳变的免疫染色试剂对照。结果应是阴性或阳性着色明显减弱（吸收不全时）。性着色明显减弱（吸收不全时）。 抑制试验抑制试验 是指用标记抗体和未标记抗是指用标记抗体和未标记抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体（可以是一抗，也可以是二抗或桥抗体）两者的混合物作试剂，其他步骤不体）两者的混合物作试剂，其他步骤不变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳变的免疫组化染色试剂对照，结果其阳性着色应成比例的减弱（等量或性着色应成比例的减弱（等量或1 1：9 9）。此试剂对照多用于直接法。此试剂对照多用于直接法。 这类阴性试剂对照的这类阴性试剂对照的选用原
9、则选用原则是：是：空白对照不能省，其他对照在预实验空白对照不能省，其他对照在预实验中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂中应尽量多做，尤其是应用新抗体试剂；对照必需与实验片同步进行染色；对照必需与实验片同步进行染色；对照的结果应附合要求。对照的结果应附合要求。 自身对照自身对照 是指在同一标记切片上的自是指在同一标记切片上的自身组织成分的阴性背景对照。身组织成分的阴性背景对照。即与靶抗原即与靶抗原阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构阳性反应细胞或成分相邻的阴性背景结构的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与的显色，结果应为阴性或着色较浅，需与阳性着色成分呈鲜明对比。目的在于排除阳性着色成分呈鲜明对比。
10、目的在于排除内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移内源性干扰产生的假阳性和因抗原弥散移位造成的错误结果。位造成的错误结果。* * 第三节第三节 非特异染色非特异染色非特异染色非特异染色是指免疫组化染色过程是指免疫组化染色过程中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳中产生的非靶抗原的呈色结果，属假阳性，又称背景着色，能严重干扰免疫组性，又称背景着色，能严重干扰免疫组化染色结果的正确判断，应竭力避免或化染色结果的正确判断，应竭力避免或减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的减轻。其原因涉及免疫组化染色流程的各个环节，可来自：各个环节，可来自： 内源性干扰内源性干扰( (自发荧光、内源酶、内源自发荧光、内源酶、内
11、源性生物素等性生物素等) )；试剂污染试剂污染( (质量差，交叉反应，质量差，交叉反应，FcFc受体受体干扰等干扰等) )；组织处理不当组织处理不当( (组织固定不及时或固定组织固定不及时或固定不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充不良所导致的抗原弥散移位、洗涤不充分所导致的游离试剂残留等分所导致的游离试剂残留等) )。纠正的方法视原因而异，可在预实纠正的方法视原因而异，可在预实验基础上，采用有针对性的纠正对策，验基础上，采用有针对性的纠正对策，即对症下药即对症下药( (具体纠正方法不展开讲了，具体纠正方法不展开讲了，同学们可以自己阅读讲义同学们可以自己阅读讲义p123-126) p123-126
12、) 。*第四节第四节 阳性标记的形态特征和判断阳性标记的形态特征和判断免疫组化标记具有一定形态特点，免疫组化标记具有一定形态特点，若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记若能熟练掌握则有助于对免疫组化标记结果的正确判断。内容包括定性、定位结果的正确判断。内容包括定性、定位和定量三方面。和定量三方面。免疫显色强度和阳性细胞密度是定免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，与抗原含量密度结合的方法综合计量，与抗原含量有关；阳性细胞的着色形态及组织分布有关；阳性细胞的着色形态及组织分布特点主要是定位指标，与功能有关。特点主要是
13、定位指标，与功能有关。一、阳性标记免疫特征：分一、阳性标记免疫特征：分“ “弱弱(+)(+)、中、中(+)(+)、强、强(+)“(+)“三级三级。免疫荧光法（。免疫荧光法（FITCFITC为例）为例） 则表现为浅绿色荧光、明显则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；绿色荧光和亮绿色耀眼荧光；免疫酶标记（免疫酶标记（HRP- HRP- DAB/HDAB/H2 2OO2 2）则则表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐表现为淡黄色细颗粒、棕黄色颗粒和褐黄色粗颗粒，后者耀眼易见。图像摄影黄色粗颗粒，后者耀眼易见。图像摄影，原则上多取强阳性区域。，原则上多取强阳性区域。二、阳性标记细胞学特征二、阳
14、性标记细胞学特征（以（以HRP-HRP-DAB/HDAB/H2 2OO2 2为例）为例） 可分为可分为胞膜型；胞膜型；胞核胞核型；型；胞质胞质( (浆浆) )型；型；微绒毛型和微绒毛型和复合型复合型（胞膜（胞膜- -胞质兼有，胞核胞质兼有，胞核- -胞质兼有，或微绒胞质兼有，或微绒毛毛- -胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与胞质兼有）等五种阳性细胞类型。这与抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织抗原所在部位相关联，但应注意排除因组织固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合固定不好引起的抗原弥散假象，尤其是复合型图像。型图像。三、阳性标记组织学特征三、阳性标记组织学特征（以（以HRP-HRP-DA
15、B/HDAB/H2 2OO2 2为例）为例） 免疫组化染色阳性细胞在免疫组化染色阳性细胞在组织中的分布排列形式可以有如下组织中的分布排列形式可以有如下7 7种：种：局灶型；局灶型；弥漫型；弥漫型；片块型；片块型；网状型；网状型；腺管型；腺管型；腔缘型和腔缘型和菊团型菊团型，等。这主，等。这主要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和要取决于抗原抗体复合物在细胞内的分布和阳性细胞在组织内的群体分布特点。阳性细胞在组织内的群体分布特点。四、阳性标记强度特征四、阳性标记强度特征 依照细胞阳性着依照细胞阳性着色程度（抗原含量），可分为弱阳性（色程度（抗原含量），可分为弱阳性（+ +） 1 1分；中等阳性（分；中等阳性（+） 2 2分；强阳分；强阳性（性（+） 3 3分。依照阳性细胞数量，分。依照阳性细胞数量，可分为：弱阳性（可分为：弱阳性（+ + ，指阳性细胞数在，指阳性细胞数在25%25%以下）以下） 1 1分；分；中等阳性（中等阳性（+,+,指阳性细胞数在指阳性细胞数在25%25%49%) 49%) 2 2分；强阳性（分；强阳性（+ + ，指阳性细胞，指阳性细胞数在数在50%50%以上以上) ) 3 3分。目前多采用积分分。目前多采用积分综合计量。综合计量。计算公式：两者相乘计算公式：两者相乘（或相或相加加）。大多主张）。大多主张44者为阳者为阳性，性，6
