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1、 硕士研究生学位论文硕士研究生学位论文 TLRTLR- -4 4 介导抵抗素调节人脐静脉内介导抵抗素调节人脐静脉内 皮细胞纤溶因子皮细胞纤溶因子 PAIPAI- -1 1、t t- -PAPA 的表达的表达 Effects of Resistin Mediated by TLR-4 on PAI-1 and t-PA Expression in Cultured Human Umbilical Vein Endothelial Cells 研 究 生：杨海燕 专 业：内科学（心血管内科） 导 师：李玉光教授 基金项目：国家自然科学基金资助 （No. 81070413） 汕头大学医学院 2012
2、 年 6 月 中国 汕头学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。 论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论
3、文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。 作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 汕头大学医学院硕士学位论文 I 摘 要 背景 血栓性疾病严重威胁人类的生命健康，其发病率高居各类疾病之首，且近年来还有渐增之势，是当代医学研究的重点和热点之一。抵抗素（resistin）作为一种新近发现的脂肪因子，与以中心性肥胖、胰岛素抵抗为主要特征的代谢综合征（metabolic syndrome, MetS）及心血管疾病的发生发展密切相关。Toll 样受体-4（toll like receptor-4, TLR-4）作为机体天然免疫的受体，参与众多心血管疾病的
4、发生发展。纤溶活性调节物质，组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen aetivator, t-PA）及纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）在血栓的形成过程中发挥重要的作用。本课题组前期研究表明，抵抗素可作用于体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)导致PAI-1、t-PA 这对纤溶因子表达失衡，从而抑制纤溶系统，但其作用受体尚不明确。据最新研究发现，抵抗素可与炎症刺激物脂多糖（1ipopoysaccharide, LPS）竞
5、争 TLR-4 调节细胞因子的表达。然而抵抗素、TLR-4 与 PAI-1、t-PA 这对纤溶因子的作用关系目前尚未见报道。 目的 体外培养HUVECs， 观察用Toll样受体-4抗体(antibody to TLR-4, AbTLR-4)阻滞TLR-4后，是否能减弱抵抗素所引起的纤溶因子 PAI-1、t-PA 蛋白和 mRNA 水平的变化，进一步探索抵抗素在 HUVECs 的信号转导通路，从而揭示血栓性疾病发生、发展的新机制，为血栓性疾病的防治提供新的理论依据和思路。 方法 1. 培养 3-5 代 HUVECs，将其分为单纯培养基对照（control）组，resistin（50ng/ml）组
6、，AbTLR-4（1ug/ml）组，resistin（50ng/ml）+AbTLR-4（1ug/ml）组，培养 48h 后，酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）法检测各组上清液中 PAI-1汕头大学医学院硕士学位论文 II 和 t-PA 蛋白水平。 2. 培养 3-5 代 HUVECs，将其分为单纯培养基对照组（control） ，resistin（50ng/ml）组，AbTLR-4（1ug/ml）组，resistin（50ng/ml）+AbTLR-4（1ug/ml）组，培养 48h 后，实时反转录多聚酶链反应（real-time r
7、everse transcription polymerase chain reaction, real-time RT-PCR）法检测各组总 RNA 中 PAI-1 和 t-PA mRNA 水平。 结果 1. resistin（50ng/ml）组较 control 组 PAI-1 蛋白水平显著升高（P0.05） ，t-PA 蛋白水平无显著变化； 2. resistin（50ng/ml）+AbTLR-4（1ug/ml）组较 resistin（50ng/ml）组 PAI-1 蛋白水平显著下降（P0.01） ，t-PA 蛋白水平无显著变化； 3. resistin（50ng/ml）组较 contr
8、ol 组 PAI-1 mRNA 水平显著升高(P0.05)，t-PA mRNA 水平无显著变化； 4. resistin resistin（50ng/ml）+AbTLR-4（1ug/ml）组较 resistin（50ng/ml）组 PAI-1 mRNA水平下降（P0.01） ，t-PA mRNA 水平无显著变化。 结论 1. 在体外培养的人脐静脉内皮细胞中， 高浓度抵抗素可显著提高 PAI-1 的表达， 而对 t-PA的表达无显著影响，从而抑制纤溶系统活性，促进血栓形成。 2. TLR-4 可能为抵抗素的一个作用受体，在体外培养的人脐静脉内皮细胞中，介导抵抗素引起的 PAI-1 的表达增加。
9、关键词 血栓性疾病；抵抗素；Toll 样受体-4；纤溶酶原激活物抑制物-1；组织型纤溶酶原激活物 汕头大学医学院硕士学位论文 III ABSTRACT Background The prevalence of thrombotic diseases is leading among all diseases and keeps rising, which has attracted more attentions of the researches. Resistin, as a recently discovered adipocytokine, is closely related to
10、the metabolic syndrome (MetS), characterized by abdominal fat and insulin resistance, and the occurrence and development of cardiovascular diseases. TLR-4, as a major receptor of nature immunity, participates in the occurrence and development of many cardiovascular diseases. Fibrinolytic factor tiss
11、ue plasminogen aetivator(t-PA) and plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1) play very important roles in the process of intravascular thrombus formation. Our team forward research showed that, high levels of resistin may lead to the imbalanced expression of t-PA and PAI-1, and then inhibit fibrinoly
12、tic system in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), however, the receptors of resistin is far from revealed. According to a new study, resistin competes with 1ipopoysaccharide (LPS) for binding to TLR-4, but the relationship between resistin, TLR-4 and t-PA , PAI-1 has not been r
13、eported now. Objective In vitro culture HUVECs, to observe whether it can reduce the effects of resistin in the protein and mRNA levels of PAI-1 and t-PA by inhibiting TLR-4. Then to study the signaling pathway of resistin in HUVECs, to reveal a new mechanism of thrombotic diseases, and provide new
14、theoretical basis and concepts for the treatment of thrombotic diseases. Methods 汕头大学医学院硕士学位论文 IV 1. HUVECs within 3-5 passages were divided into 4 experimental groups: control (medium only), resistin(50ng/ml), AbTLR-4(1ug/ml), AbTLR-4(1ug/ml) + resistin (50ng/ml). After incubation for 48h, the leve
15、ls of PAI-1 and t-PA antigen in the supernatant were assayed with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). 2. HUVECs within 3-5 passages were divided into 4 experimental groups: control (medium only), resistin(50 ng/ml), AbTLR-4(1ug/ml)，AbTLR-4(1ug/ml) + resistin (50ng/ml). After incubation for 48
16、h, the levels of PAI-1 and t-PA mRNA were detected by real-time reverse transcription polymerase chain reaction (real-time RT-PCR). Results 1. Compared with control (medium only), PAI-1 protein levels increased significantly(P0.05), t-PA protein levels didnt change significantly of Resistin(50ng/ml). 2. Compared with resistin(50ng/ml), PAI-1 protein levels decreased significantl
