《rna干扰her-2基因对人乳腺癌细胞株skbr3细胞周期及增殖影响的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《rna干扰her-2基因对人乳腺癌细胞株skbr3细胞周期及增殖影响的研究（38页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、G O G 1p h a s eb y9 8 4 w i t has i g n i f i c a n td e c r e a s ei nt h ep e r c e n t a g eo fc e l l si nS - p h a s eb y18 p s h R N A - H E R 一2r e d u c e dH E R 2g e n ee x p r e s s i o nb y3 2 ，p s h R N A - G F Ps t r o n g l yd e c r e a s e dt h eg r e e nf l u o r i n ep r o t e i ne
2、 x p r e s s i o nu n d e rf l u o r o s c o p e C o n c l u s i o n s ：1 T h ev e c t o rt a r g e t i n gH E R 2g e n e , r m m e dp s h R N A H E R 2 1p s h R N A H E R 2 2 ，w a sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y ；2 B o t hp s h R N A H E R 2 1a n dp s h R N A - H E R 2 2e a r li n h i
3、 b i t e dH E R 2g e n ee x p r e s s i n g ；3 S u c c e s s f u l l yf i n dt h eH E R 2g e n e SR N Ai n t e r f e r i n gs i t e ：N M _ 0 0 4 4 4 8 ( 5 0 7 - 5 2 8 ) ：A A G G A C A T C T T C C A C A A G A A C4 p s h R N A H E R - In o to n l yd e c r e a s e dH E R 2e x p r e s s i o n ，b u ta l
4、s oi n d u c e dc e l lc y c l ea r r e s ta n di n h i b i t e dc e l l u l a rp r o l i f e r a t i o n ；K e yw o r d s ：R N AI n t e r f e r e n c e ：s h R N A ；E p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r一2 ；B r e a s tc R r l c e r ；41 L L日【l舌H E R - 2 ( e - e r b B 2 , n e u ) 原癌基因产物
5、是上皮细胞生长因子受体( E G F R ) 家族中的一个重要成员，编码一t 8 5 k D a 有酪氨酸激酶活性的跨膜受体糖蛋白( p 1 8 5 H E ”) ，在浓度很低时，H E , R - 2 受体以单体形式存在，只有很小的酪氨酸蛋白激酶活性，增加H E R 一2蛋白的浓度可以导致其持久的酪氨酸激酶活性的增强。虽然至今还未发现H E R 2 蛋白受体的确切配体，但其家族成员H E R - 1 ( E G F R ) 、H E R - 3 与H E R - 4 与配体结合后，通过与H E R - 2 形成异二聚体而激活H E R 一2 ，而且，不同于其它家族成员的是，H E R 2 在
6、缺乏配体激活的情况下仍可自身形成二聚体，保持内源性酪氨酸激酶活性。H E R 2 激活后引起下游蛋白的磷酸化而激活多种信号转导通路，影响细胞的增殖、分化、迁移、黏附、存活、凋亡，使得细胞增殖加快、细胞周期加速、恶性表现增强，并出现抗凋亡及对对多种化疗药物产生耐药f 2 】。大量研究表明，H E R - 2 高表达与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切。约有高达3 0 的乳腺癌患者伴随有H E R - 2 及其基因产物的过表达孙，H E R - 2 过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。H E R - 2 高表达的病人采用辅助化疗、放疗、激素治疗或联合治疗对病人的生存率无明显影响【4 】睁1 。
7、可见H E R - 2 过表达在乳腺癌发病、发展、转归中的重要作用。近年来，选择H E R - 2 原癌基因或p l8 5 H E R - 2 n e u 作为乳腺癌的治疗靶点已经越来越引起人们的关注【6 l 。H e r e e p t i n ( 赫赛汀) 是一种人源化的靶向p 1 8 5 H E R - 2 n e u 的单克隆抗体，是第一个靶向癌基因治疗乳腺癌的药物，研究表明，H e r c e p t i n 无论单用还是与化疗药物合用均表现出良好的抗肿瘤活性1 7 嘲，已于1 9 9 8 年9 月在美国获准上市。然而，单克隆抗体作用于已表达的蛋白，并不是理想的作用方式。H e r
8、c e p t i n 仅与细胞膜上的p 1 8 5 呱辩撕发生作用，胞内p 1 8 5 H E P 2 n e u 表达的增加可以先于单克隆抗体与细胞膜上的p 1 8 5 H E R - 2 n e u 作用而传递丝分裂信号【9 】：从肿瘤细胞膜上脱落的可溶的p 1 8 5 H E R - 2 n e u 胞外片段还可以与结合到肿瘤上的抗体相互作用，降低了抗体的抗肿瘤活性【l o l 。R N A 是一种独特的靶点，是一个从基因到蛋白的重要桥梁，守卫着遗传信息的正常进行。与作用于蛋白水平的靶向药物对比，以R N A 为靶点的基因治疗药物应该更直接、更彻底且更有效率。已有报道一作用于起始密码子
9、附近的反义寡核苷酸在m R N A及蛋白水平抑制H E R - 2 的表达，并在细胞和整体水平抑制H E R - 2 高表达的乳腺癌细胞及肿瘤的生长【川【1 2 】。但由于反义核酸技术存在易降解，有效剂量大，特异性低、细胞毒性大等缺点，难以在临床开展。R N A 干扰是一种古老的真核生物基因组的防御系统，它被用来对抗诸如转座子、病毒等可运行的遗传物质的侵犯【”l1 1 4 。较基因敲除技术和反义R N A 技术来说，R N A干扰技术是目前最有效的基因沉默技术，能够在不改变哺乳动物基因组基础上降低特异基因的表达制作多种表型，产生基因敲除的效应。由于其具有快速、高效、特异、操作简便的特点，2 0
10、 0 2 年被S c I E N C E 评为十大科技之首1 15 1 ，2 0 0 4 年被评为十大科技之四。如果通过体外途径来增强和放大细胞内的这一防御系统，使它能有效地抑制那些不正常的基因如肿瘤相关基因、致病基因的表达，从而达到基因治疗的目的。我们课题的意义是：如果能用R N A 干扰技术抑制乳腺癌H E R 2 基因的表达抑制其受体酪氨酸激酶活性，抑制其下游的信号传导；从而削弱肿瘤的生长和浸润能力，进而为H E R - 2 阳性的乳腺癌治疗提供新的策略。6附：实验设计流程针对H E R 0 2 设计2 个s i R N A 靶位点合成编码s h R N A 的寡核苷酸 构建p s h
11、R N A H E R 2 1 、p s h R N A H E R 2 2 真核表达载体，同时构建阴性对照p s h R N A n o n s p e c i a l 、阳性对照p s h R N A - G F P转化大肠杆菌D H 5 a ，提取并纯化质粒i脂质体转染S K B r 3 细胞选出抑制作用强的s i R N A 靶位点jF A C S 检测细胞周期M T T 比色分析及集落形成试验检测细胞体外增殖活力。+实验材料1 、主要仪器和试剂1 1 主要设各：荧光倒置显微镜h N i k o nT E 2 0 0 ；B e c k m a n 高速冷冻离心机；P E2 4 0 0P
12、 C R 扩增仪：D Y Y - I I l 8 8 B 型稳压稳流定时电泳仪( 北京六一仪器厂) ；D K 8 D 型电热恒温水槽( 上海精宏设备有限公司) ；Z F A I 型紫外投射分析仪( 上海上明光学电子仪器厂) ：电子分析天平：M i l l i Q 超纯水制备系统( M i l l p o r e ) ：N a t i o n - 2 0 低温冰箱( 日本) ；一8 0 低温冰箱( 美国) ；B i o - - R a dm o d e l6 5 0 酶标仪；A l p h a i m a g e r 刑2 0 0 0 凝胶自动成像分析仪( 安莱公司) ；B H C 110 0
13、I I I A B 2 型生物安全柜。1 2 质粒和大肠杆菌菌株：感受态大肠杆菌D H 5 a 由福建省肿瘤医院肿瘤分子生物研究室保存；真核表达质粒p I R E S G F P 由福建医科大学附属协和医院许贞书博士馈赠；真核表达质粒p S i l e n c 矗。M n e O3 1 H I 购自A m b i o n 公司；该质粒含有人巨细胞病毒启动子、新霉素、氨苄青霉素抗性基因的真核表达载体。本实验在启动子下游的M C S A 的酶切位点B a m H l 与H i n d I l I 之间插入双链H E R 2 一s i R N A片段，获得真核表达质粒p S i l e n c e
14、r r M H E R 2 。真核表达质粒p S i l e n c e r T M - n o n s p e c i a l 由A m b i o n 公司提供。图1p S i l e n c e M 质粒图谱1 3 主要试剂限制性内切酶B a m H 、E c o l R j 、H i n d I I I 、T 4 D N A 连接酶、1 0 0 b p D N Al a d d e r 购自T a K a R a 生物技术公司；质粒抽提试剂盒购自华舜生物工程有限公司；细胞总R N A 抽提试剂T r i z o l T M 试剂购自G I B C O B R L 公司；L i p o
15、f e c t a m i n e2 0 0 0 购于i n v i t r o g e n 公司；M o u s eM o n o c l o n a lA n t i b o d yH E R 2A b 一18 、M M u L V 逆转录酶、T a q D N A 聚合酶L AT a q D N A 聚合酶购自生物晶美；细胞培养基及G 4 1 8 购于G I B C O 公司，M T r 购于S i g m a 公司；实验所用试剂均为进口或国产分析纯试剂。1 4 实验细胞高表达H E R - 2 的乳腺癌细胞系S K B r 3 购于湖南远泰生物技术公司。9实验方法1 设计针对H E R
16、 - 2 的s i R N A 靶位点1 1G e n e b a n k 中查得H E R 2e D N A 的全长序列。位置1 7 q 2 1 1长度4 5 3 0 b p编号N M _ 0 0 4 4 4 81 2 按照s i R N A 的设计原则【1 6 1 ，利用A m b i o n 公司的在线设计软件选出2 个针对H E R 2的s i R N A 靶序列，并行B L A S T 同源搜索确定为特异性序列。N O 1 ( 5 0 7 - 5 2 8 ) ：A A G G A C A T C T T C C A C A A G A A CN O 2 ( 2 2 9 6 2 31 7 ) ：A A A T C T T A G A C G A A G C A T A C G2 合成编码短发夹状s i R N A 的D N A 模板2 1 根据A m b i o n 公司在线设计软件将s i
