宋内氏痢疾菌侵袭相关基因的克隆与表达

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1、遗传 H E R E D I T A S ( B e iji n g ) 1 5 ( 1 ) : 1 7 - 1 9 1 9 9 3宋内氏痢疾菌侵袭相关基因的克隆与表达罗振革高杰英 孔祥英 苏 新（ 军事医学科学院 徽生物流行病研究所，北京 1 0 0 8 5 0 )T h e C l o n i n g a n d E x p r e s s i o n o f I n v a s i o n A s s o c i a t e d G e n e s o f S h i g e l l a s o n n e i L u o Z h e n g e G a o J i e y i n g

2、Ko n g Xi a n g y i n g S u Xi n( I n s t i t u t e o f Mi c r o b i o l o g y a n d E p i d e m i o l o g y , T h e A c a d e m y o f Mi l i t a r y Me d i c a l S c i e n c e s , B e i j i n g 1 0 0 8 5 灼用粘粒P J B 8 为载体，构建了 宋内氏 痢疾茵I 相大质粒基因库用菌落原位杂交，We s t e r n b l o t 方法从文库中筛选到 1 株表达 I p a A , B ,

3、C , D 4 种蛋白的重组子经重组质粒酶切和 S o u t h e r n b l o t 等方法对宋内氏菌和福氏 2 a 痢疾菌的 侵袭相关基因片段作了 初步比 较分析。关挂词宋内氏痢疾菌，I 相大质粒，粘粒，基因库，侵袭相关基因痢疾菌的毒力是由多因子决定的 8 ) ，其中由1 8 0 -2 3 0 k b 大质粒编码的侵袭相关蛋白 ( I p a )可被不同型痢疾菌感染的猴恢复期血清识别，是痢疾菌的重要毒力决定簇在侵袭肠上皮 细胞过程中 起着关键作用 a ) . I p a 存在于菌体外膜，虽然在菌体总蛋白中 所占 的比 例较小，但 We s t e rn b l o t 显示它们具有

4、较好的免疫原 性 7 ) 有报道认为具侵袭力的活菌苗有较好的免疫保 护作用 ”。因此 侵袭相关蛋白 （ I p a ）在痢疾活菌苗构建中 可能具有潜在的价值 本文介绍用 粘粒p J B 8 为载体克隆宋内氏菌的i p a 基因片段的过程，并对宋内氏和福氏2 a 两种痢疾菌的ip a 基因片段作了初步比较。材 料 和 方 法（ 一）菌株和质粒 实验中所用菌件和质粒列于表1 :表 1 菌株和质粒菌株或质粒特性来源S . s o n n e i S 6 3E. c o l i K-1 2 HB1 0 1SH2 9 p J B 8 p MYS H6 5 0 3 p H W 6 2 6 p R M 1

5、7含1 8 0 k b 质粒 ， s e r e n y t e s t F - , r B MB 一r e c A 一A - A p , 表达I p a A , B , C , D A p , 5 .4 k b c o s m i d A P ， 含F 2 a 大质粒 l k b 的F片段 T c C m 含 S . s o n n e t 的4 . 1 k b i p a 基因片段 A V r ， 含福氏5 b 的 1 7 k b i p a 基因片段本室 本室 本 工 作 法国巴斯德研究所馈赠 兰州生物制品 所提供 日 本国立卫生研究所提供 澳大利亚T a y l e r 提供1 7 （

6、 二）载体的制备 常规碱变性法提取粘粒p J B 8 质粒，两份样品分别经S a ll , Hi n d II I 酶切，经碱性磷酸酶脱磷 酸后分别用B a m H I 酶切，收集 S a f - B a m H I 酶切小片段，Hin d M- B a m H I 酶切大片段作为载体 两臂载体两臂分别含一个被包装蛋白 识别的。 。 ： 位点A p 基因位于Hi n d M- B a m H I 酶切大 片段上 （ 三）外源D N A的制备 K a d o L i u 改良 法 5 提取S .s o n n e i S 6 3 的大质粒，经C s c l 密度梯度超离心纯化，S a u 3 A

7、部 分酶切，回收3 0 -5 0 k b的D NA片段 （ 四）体外包装及转导 p J B 8 载体两臂与 3 0 -5 0 k b的大质粒片段以l : l : l 的比例 （ 摩尔比）经T 4 连结酶连接， 连结反应物经包装蛋白休外包装形成噬菌体颗粒，感染受体菌E . c o l i K - 1 2 HB I O I ，被感染的受 体 菌涂于含A p 的培养基上， 培养过夜， 长出 的菌落即为含有外源D N A片 段的重组子 所用包 装蛋白 包装效率为2 X 1 0 丫 f u / u g A D N A . 体 外包装 和转导均按文献进行( 6 ) （ 五）探针标记及菌落原位杂交 寡核昔酸

8、引物法同位素标记分 别位于p H W6 2 6 和p R M1 7 上的4 . 1 k b 及 1 7 k b 的i p a 基因片 段以 及p MY S H 6 5 0 3 的1 .O k b F 片 段作为 探针 （ F 基因 对I p a 的 表达起正调控作用） 菌落原位杂 交按分子克隆常规法操作。 （ 六）We s t e r n b lo t 检测 待检菌株接种贺氏肉汤，培养过夜全菌抽提物作为样品进行聚丙烯I ft 胺凝胶电泳，经转移 电 泳 将蛋白 带 转 移到 硝 酸 纤 维素 膜 上， 与 感 染 痢 疾菌 的 猴 恢 复 期血清 反 应， 用 生 物素 一 亲 和 素 一 酶

9、法检测阳性蛋白带。具体操作见文献 1 ) , （ 七）皿组质粒陇切及S o u t h e r n b lo t 分析 重组质粒经S a l t 酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为0 .7 %，电泳后转移到硝酸纤维素膜 上，用 1 7 k b探针进行 S o u t h e r n b l o t 分析结 果 与 讨 论（ 一）宋内氏菌大质粒基因库的构建 p J B 8 经双酶切法制备的载体两臂与3 0 -5 0 k b的S .s o n n e i S 6 3 大质粒片段连结，经体外包装 系统形成噬菌体颗粒感染受体菌HB 1 0 1 ，用氨节抗性筛选出含大质粒DN A片段的重组子 2 7 0

10、 多个重组质粒大小约5 0 k b ，符合c o s m i d载容范围按公式计算如果插人外源D N A片段大小 为3 0 -5 0 k b ，则 1 4 -2 5 个重组子将有”的机率包含所有的大质粒DN A片段，我们得到的 重组子远超过此数，证明成功地构建了宋内氏大质粒的基因库 （ 二）i p a 阳性盆组子的筛选 用4 . l k b , 1 7 k b的ip a 相关基因探针和1 .O k b F基因探针与重组子进行菌落原位杂交，阳性 株中 含有与痢疾菌侵袭相关基因同源的D NA片段，共得到 1 3 个探针杂交阳性的克隆子 （ 三）皿组子的蛋白表达 用感染痢疾菌的猴恢复期血清对重组子进

11、行We s t e r n b l o t 分析重组子 （( S H 2 9 )表达了与 1 8野生型宋内氏菌 S 6 3 相对应的 I p a A , B , C , D蛋白带，分子量大小分别约 7 8 k D, 5 7 k D, 4 2 k D , 3 8 k D但表达水平低于野生株菌落原位杂交显示S H 2 9 与F 基因片段无同源性克隆 株中缺少对i p a 基因表达起正调控作用的F基因，导致其表达水平比野生菌低。另外，大肠杆菌 和痢疾菌胞内环境和遗传背景的差异也可能导致基因 表达的不同 （ 四）皿组质粒酶切及S o u t h e r n b lo t 分析 D H 9 1 为 本室

12、以前 得到的可表达福氏2 a 痢 疾菌4 种侵袭相关蛋白 的 重组子 2 ) ， S H 2 9 为 本 文中的表达宋内氏痢疾菌侵袭蛋白的重组子用S a f 对两重组子质粒进行酶切，二者都有一个 1 5 k b 左右片段 （ 图1 ) . S o u t h e r n b l o t 显示此片段与1 7 k b 探针呈阳 性杂交 （ 图2 ) 。说明此片段 在两种痢疾菌中的保守区 域，可能与I p a 的表达有关2 3 . 1 kb9 . 4 k b6 . 6 k b1 5 k b4 . 4 k b2 . 3 k b 2 . d k b图1重组质粒酶切分析 1 . A D N A经Hi n

13、d 1 1 1 醉切作为分子蚤标准； 2 -5 . S 6 3 . F 2 a , S H 2 9 , D H 9 1 质粒分别经S a l I 酶切图2重组质粒的S o u t h e rn b i o t 分析 1 -4 示 DH9 1 , HS 2 9 , Ma , S 6 3 经S a l I 酶切后与 1 7 k b 探针 杂交，侵袭相关蛋白的精确基因图和侵袭蛋白的生物学活性还有待深人研究。参考文献( 1 金灵，苏新：1 9 9 0 .徽生物学报3 0 ( 1 ) : 4 8 . ( 2 刘学博等：1 9 9 0 中华徽生物学和免疫学杂志1 0 ( 3 ) : 1 6 3 . ( 3

14、 ) F o r ma l , S . B . e t a l . : 1 9 8 4 . I n f e c t . I mmu n . , 4 6 : 4 6 5 . ( 4 ) Ha l e , T. L. e t a l . : 1 9 8 3 . I n 介c t . I mmu n， 4 0 : 3 4 0 . ( 5 ) Ka do , C. 1 . e t a l . : 1 9 81 J. Ba c t e r l ol , 1 45 : 1 36 5 . ( 6 ) Ma u r e l l i . T. e t a l . ： 1 9 8 5 . I n 介c t . I mmu n , 4 9 : 1 6 4 . ( 7 ) Oa k s . EN . e t a l . : 1 9 8 6 . I n f e c t . I mmu 二5 3 : 5 7 ( 8 ) S a k a i , T. e t a l . : 1 9 8 6 . I n f e c t . I mmu n . , 5 1 : 4 7 6 .本文于 1 5 9 1 年 6 月 2 2日收到。 1 9