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1、2005-11-251高效液相色谱技术高效液相色谱技术生物化学教研室何光耀生物化学教研室何光耀电话：电话：873306212005-11-252?高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱（HPLC）作为一种十分重要的作为一种十分重要的分离分析技术分离分析技术；?高效液相色谱高效液相色谱在在分辨率、选择性、灵敏度分辨率、选择性、灵敏度以及以及生物制品的纯化生物制品的纯化等方面显示出等方面显示出独特的能力独特的能力；?HPLCHPLC已成为80年代以来国际分析化学界已成为80年代以来国际分析化学界发展最快发展最快的一个分支，无论是仪器的的一个分支，无论是仪器的销售额销售额，还是还是论文的发表数，论文的
2、发表数，均雄居同期所有分析仪器的均雄居同期所有分析仪器的首位首位. .?HPLCHPLC已成为当今发达国家中各类生命科学实验室和医院中已成为当今发达国家中各类生命科学实验室和医院中必不可少的基本仪器。必不可少的基本仪器。2005-11-253亲和色谱法亲和色谱法2005-11-254柱色谱柱色谱装载 样品装载 溶剂重力 洗脱玻璃柱硅胶 氧化铝 纤维素 糖类粉末滤网1050100150Volume (mL)Time (hr)1.02.03.04.02005-11-2551. 1. 高效液相色谱仪的基本结构和原理高效液相色谱仪的基本结构和原理高效液相色谱仪的基本结构和原理高效液相色谱仪的基本结构和
3、原理?高效液相色谱仪依据分离的原理虽有不同的类型，如吸附、亲和、分配、离子交换、凝胶色 谱吸附、亲和、分配、离子交换、凝胶色 谱等,但仪器组成并无太大的差异。?仪器结构:一般由溶剂输送系统（泵泵）、进样系统（手动和自动进样器进样器）、分离系统（色谱 柱色谱 柱）、检测系统（检测器检测器）和色谱工作站色谱工作站 （系 统控制与数据处理）等构成,如图所示;?根据实验需要还可能配置在线真空脱气机在线真空脱气机、温 度控制系统（柱温箱柱温箱）和馏分收集器馏分收集器等。2005-11-256高效液相色谱高效液相色谱进样器检测器色谱图色谱柱溶剂混合器(HPLC)2005-11-2571 11 1 溶剂输送
4、系统溶剂输送系统溶剂输送系统溶剂输送系统?溶剂输送系统溶剂输送系统主要的部件是输液泵输液泵，它的作用是将流 动相稳定地、准确地输送到色谱系统内。?如需梯度洗脱，必须配备两个输液泵或一个多元泵由 色谱工作站或控制器编辑时间程序进行梯度控制。?主要的设置参数是主要的设置参数是：?流速（mL/min）流速（mL/min）流速是一个影响分离效果的参数， 主要是根据色谱柱的类型以及长度、直径、填料的粒 径大小的不同进行设定；?上限压力（bar或psi）上限压力（bar或psi）上限压力主要根据色谱柱的 最大工作压力设定，目的是保护色谱柱，避免过压而 使柱子受损。2005-11-2581 12 2 进样系
5、统进样系统进样系统进样系统高效液相色谱仪的进样系统要求：?能将样品准确地注入到系统中，而不破坏在色谱柱和检测器里所建立的流量平衡；?在不同的进样量下具有很宽的线性范围、很高的重现性、可以忽略的样品残留。常见的进样器有：手动进样器（六通阀）手动进样器（六通阀）和自动进样器。自动进样器。2005-11-259ToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFrom PumpTo Waste手动进样器六通阀手动进样器六通阀2005-11-25101 13 3 分离系统分离系统分离系统分离系统
6、?分离系统分离系统主要是色谱柱色谱柱。?色谱柱的作用是把样品中的组分分离，是色谱仪最重要的部件之一。?色谱柱的高效率是现代高效液相色谱仪的一个显著特点。?为达到好的分离效果，色谱柱的选择尤为重要。为达到好的分离效果，色谱柱的选择尤为重要。2005-11-25111 14 4 检测系统 检测系统 检测系统 检测系统?在高效液相实验中所选用的检测器检测器，必须满足我们所分析样品中感兴趣组分的检测要求。也就是说，对我们所关心的组分有较高的灵敏度灵敏度和较好的选择性选择性，有很低的最小检出量，有较宽的线性范围线性范围。常用的检测器有以下几种：2005-11-2512. . . 紫外及可见光检测器紫外及
7、可见光检测器紫外及可见光检测器紫外及可见光检测器?基本结构：与紫外可见分光光度计相同；?遵循的基本原理：朗伯比尔定律。?这种检测器只能用于在工作波长范围内有吸收的样品有吸收的样品，可分为三个类型。2005-11-2513紫外可见检测器紫外可见检测器根据Beer定律，通过检测池透射光的强度与溶质浓度成正比。I0= 入射光强度I = 透射光强度A = 吸光度a = 摩尔吸光系数b = 检测池长度c = 溶质浓度IICboDetector CellLog = A = abcI0I2005-11-2514（1 1）固定波长检测器）固定波长检测器?以滤光片分光以滤光片分光，根据所需波长选用相应的滤光片。
8、?结构简单，价格便宜，一般用于蛋白纯化蛋白纯化方面。2005-11-2515（2 2）可变波长检测器）可变波长检测器?旧的产品是以棱镜分光以棱镜分光，以指拨开关选择所需波长，检测信号一般只有模拟输出。?新的产品是以光栅分光以光栅分光，用控制面板上的数字键盘，或直接由色谱工作站的控制界面设定波长，检测信号一般同时有数字输出和模拟输出，便于与色谱工作站通讯作数据处理。?配置这类检测器，适合作一般的分析实验分析实验以及产品质量控制。质量控制。2005-11-2516（3 3）二极管阵列检测器）二极管阵列检测器?这类检测器是近十几年发展起来的新型检测器。?该检测器采用5121024个光电二极管作检测，
9、所以在作色谱分析时，不但能得到分析全过程的色谱图色谱图， 同时还可以得到所有组分峰的光谱图光谱图 (3D谱图)，而 不必象传统的检测器那样需要停泵扫描。?加上强大功能的色谱软件的支持，可以作作光谱检索， 峰纯度分析，光谱检索， 峰纯度分析，还便于我们还便于我们对感兴趣组分的检测波长 进行优化对感兴趣组分的检测波长 进行优化。?这类检测器比较昂贵，适合于中草药、天然未知物 的分析以及产品与方法的研究开发。适合于中草药、天然未知物 的分析以及产品与方法的研究开发。2005-11-25172005-11-2518DAD - Peak PurityGraphical and Numerical Res
10、ults200200400400Purity Match 764Purity Match 999impurepureSignalSpectraWavelength (nm)Wavelength (nm)Time (min.)7.67.88.08.28.62005-11-25191 14 42 2 荧光检测器荧光检测器荧光检测器荧光检测器?基本原理和仪器结构与荧光分光光度计相类似。?以滤光片分光为特征的固定波长检测器为第一代产品；?以棱镜分光、只有模拟信号输出为特征的可变波长检 测器为第二代产品；?以光栅分光、由微机控制、同时有数字信号输出和模 拟信号输出为特征的可变波长检测器为第三代产品。?最
11、新产品无论是激发光，还是发射光，均可作波长扫 描，得到所分析组分的激发光谱和发射光谱，增强了 它的定性功能。2005-11-2520荧光检测器的用途与特点：荧光检测器的用途与特点：?用于用于荧光物质荧光物质的检测；的检测；?选择性和灵敏度均优于紫外及可见光检测器。选择性和灵敏度均优于紫外及可见光检测器。2005-11-25211.4.3 1.4.3 示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器示差折光检测器?检测原理：由于各种物质具有不同的折射率， 溶剂和样品各组分折射率存在一定差异，所 以通过检测折射率的变化，就可以达到分析 样品组分的目的。?是一种非选择性检测器，基本上对所有被测 对象均有响
12、应，非选择性检测器，基本上对所有被测 对象均有响应，但灵敏度较低，不适合做痕 量分析，也不适合作梯度洗脱。?多用于制备色谱和凝胶色谱，也用于糖类等 无吸收物质的分析。无吸收物质的分析。2005-11-2522InstrumentationRefractive Index DetectorsSampleReferenceSample CellReference CellPhotodiodesBeam Deflection Fresnel Prism Laser InterferometerReference Sample2005-11-2523?除以上几种常见的检测器外，还有电化学检测器，电导检
13、测器电化学检测器，电导检测器，蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器，质谱检测器质谱检测器等。2005-11-2524检测器使用统计检测器使用统计43.0%22.0%10.0%8.0%7.0%5.0%1.0%4.0%UV-VISDADFluorescenceRefractive IndexElectrochemicalConductivityMass specOthers2005-11-25252005-11-25261 15 5 柱温箱柱温箱柱温箱柱温箱?柱温也是优化色谱条件的一个参数柱温也是优化色谱条件的一个参数，现有的氨基酸分析方法，都不是在室温条件下完成的。?一套功能完善的高效液相色谱仪，不
14、可缺少柱温箱.?柱温箱有两种类型：一种是用发热丝（板）为加热材料，它只能控温高于室温，控温精度0.5；另一种是用帕尔帖（Peltier）作控温材料，它既可升温又可降温，控温由低于室温10到80，控温精度0.05。2005-11-25271 16 6 HPLCHPLC的工作过程的工作过程的工作过程的工作过程?贮液瓶中的流动相流动相（经过脱气脱气）由梯度控制器按所 需比例进行混合混合，在输液泵的作用下输送到色谱系 统中。?液态样品由进样器注入样品由进样器注入后，被来自输液泵的流动相 带入色谱柱带入色谱柱，并在其内的两相中进行反复多次的分 配反复多次的分 配等过程，直至各组分分离（这是理想状态）。?
15、分离后的各组分随流动相依次流过检测器的流动池 被检测及记录。分离后的各组分随流动相依次流过检测器的流动池 被检测及记录。结果如图32所示。?如果感兴趣的组分未能分开，则还需进一步优化色 谱条件，使之达到分离。2005-11-2528液相色谱的分离过程液相色谱的分离过程液相色谱的分离过程液相色谱的分离过程2005-11-25291 1 1 17 7 7 7 色谱的流出曲线和定性定量分析的依据色谱的流出曲线和定性定量分析的依据色谱的流出曲线和定性定量分析的依据色谱的流出曲线和定性定量分析的依据色谱的流出曲线色谱的流出曲线2005-11-2530图中图中 t t0 0：不保留组分的保留时间（即死时间
16、）不保留组分的保留时间（即死时间）, , 反映系统的死体积的大小；反映系统的死体积的大小；t tR R：保留时间，保留时间，保留时间，保留时间，是是是是色谱定性分析色谱定性分析色谱定性分析色谱定性分析（确定（确定（确定（确定是否为某一组分）是否为某一组分）是否为某一组分）是否为某一组分）的依据的依据的依据的依据; ;WW：峰宽，它反映峰宽，它反映柱效柱效的高低。的高低。?色谱峰的峰高峰高或峰面积峰面积是某一组分在该检测器的响应值，是与这个组分的浓度相关与这个组分的浓度相关，所以是色谱定量分析的依据定量分析的依据。2005-11-25311 18 8 色谱分离原理色谱分离原理色谱分离原理色谱分离原理2005-11-2532（1 1）吸附色谱法）吸附色谱法 （液固色谱法）（液固色谱法）?固定相是固体固体吸附剂
