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1、评述与进展药物配体与生物大分子受体 相互作用核磁共振的研究进展纪竹生1 ,2 刘买利2 胡继明311(武汉大学分析测试中心,武汉430072)2(中国科学院武汉物理与数学研究所波谱与原子分子物理国家重点实验室,武汉430071)摘 要 药物与生物体内目标大分子之间的相互作用,是决定药物药理活性和代谢稳定性的主要因素。如何快速高效地识别出能与靶分子相互作用且能抑制其体外活性的药物分子,是制药工业普遍关注的问题。核磁共振已经成为研究小分子配体和生物大分子相互作用的一种非常重要的手段。检测小分子配体信号在作用过程中的变化以识别药物分子,是核磁共振进行药物筛选的主要方法之一。本文介绍了近年来这方面的研
2、究进展。关键词 核磁共振,药物筛选,评述2002212222收稿;2003205226接受 本文系中国科学院武汉物理与数学研究所波谱与原子分子物理国家重点实验室资助课题(No. 991508)1 引 言大多数药物分子均通过与生物体内的大分子(如蛋白质)结合起作用。因而要得到一个具有良好生物利用度(bio2availability)、 代谢稳定性和低毒性的药物,首先必须寻找到和生物靶分子高度亲和性和选择性结合的分子(通常称为先导化合物,lead compound)。为了能快速地寻找到这种分子,近2 0年来人们研究了许多方法。这些方法主要涉及两个过程:即寻找先导化合物,然后对其进行优化1。前一过程
3、涉及到与靶分子相互作用且能抑制其体外活性的药物分子的识别,后一过程则是根据体外活性、生物利用度、 药理和毒理性质对潜在药物进行优化。在以结构为基础的药物设计过程中,核磁共振(NMR)方法被典型地用于先导化合物的优化,该研究包括蛋白质或蛋白质2配体络合物的溶液结构测定和用同位素编辑/滤波或核Overhauser效应(nuclear Overhauser effect , NOE)技术迅速测定在蛋白2配体络合物中配体的结构2。最近,人们发现NMR也可以用于药物发现过程中寻找先导化合物3。在该应用中,核磁共振被用于快速、 高效地测定分子间的相互作用,在原子水平上获得信息,指导以结构为基础的药物设计。
4、在配体与受体发生作用时,许多NMR参数将发生变化,这就是NMR能用于药物筛选的主要原因。NMR可用多种方法测定药物和蛋白的相互作用,如化学位移变化、 线宽变化、 转移NOE及脉冲梯度场实验(pulsed2field gradient ,PFG)等411。这些方法可以分为检测蛋白信号和检测配体信号。前一类型的主要代表为SAR by NMR (structure activity relationship by NMR)12,该方法需要知道靶蛋白确切的三维结构,同时还必须有足够量的15N标记的靶蛋白,因此具有一定的局限性。后一类型则采用脉冲梯度扩散测量、 转移NOE或NMR线加宽来检测小分子配体信
5、号。与观测蛋白信号相比,观测配体信号有很多优点,同时观测混合物中所有小分子信号有助于识别与靶蛋白结合的特定成分而无须去卷 积。更重要的是,直接观测配体,排除了对蛋白进行同位素标记的需要,因而允许目标蛋白有较大的分子量。正是这两点限制了SAR by NMR的应用。本文将介绍这些技术的近期发展。2 亲和磁共振(affinity NMR)亲和磁共振是近年来出现的一种研究受体2配体相互作用的方法13,它将与特殊受体有结合作用第32卷 2004年11月分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry第11期 14211425的
6、活性配体从与非活性化合物组成的混合物中识别出来。由于亲和磁共振不需要对混合物进行物理分 离,也不需要去卷积步骤,因此它能提高药物筛选的效率和准确性。亲和磁共振方法的基本前提是:当 配体与受体结合时,该低分子量配体的扩散速率发生明显的变化,其结果是结合和非结合配体的扩散系 数明显不同,从而允许采用PFG实验14 ,15从该配体和众多与靶蛋白无结合作用的分子的混合物中对该配体进行识别。PFG实验常用于测定分子的扩散系数,该实验常用的两个脉冲序列为纵向涡流延迟(longitudinaleddy2current delay , LED)16和双极性脉冲纵向涡流延迟(bipolar pulse long
7、itudinal eddy2delay , BPP2LED)17。通过增加梯度强度或持续时间,LED和BPP2LED序列可以扩展为多维形式,其中一个轴表 示的是扩散系数。这两个序列也可以和传统的多维NMR实验相结合,通过扩散系数增加谱分辨率。简而言之,结合PFG扩散排序方法的多维实验就称为扩散排序谱(diffusion2ordered spectroscopy ,DOSY)18。由于DOSY谱能够根据混合物中各成分扩散速率及化学位移的变化分离化合物的NMR 信号,且非常方便和无破坏性,此方法已成为分析复杂混合物19、 研究分子相互作用20及测定络合常 数21的常用工具,甚至化合物的分子量分布也
8、可以用此方法进行测量22 , 23。然而,如果两个不同化合 物的化学位移发生重叠,且它们的扩散系数相差不大,则处理扩散系数的拉普拉斯变换将不能分辨来自这两种化合物的信号,只在平均扩散系数处出现一个单峰24。由于用于高速筛选或来自组合化学合成 的混合物常常由结构相似的分子组成,所以上述问题是DOSY方法的一个很大缺陷,近年来,人们开发 出了许多减少化学位移重叠的DOSY实验方法。Wu等24提出了一系列结合LED序列和极化转移增强不灵敏核(insensitive nuclei enhanced bypolarization transfer , INEPT)或无畸变的极化转移增强(distorti
9、onless enhancement by polarization trans2fer , DEPT)的DOSY实验,利用13C核比1H核宽得多的化学位移范围,并对CH、CH2、CH3基团进行谱 编辑,获得了更多的结构信息,减少了峰重叠的可能性。NOE相关谱(NOE spectroscopy , NOESY)和全相关谱(total correlation spectroscopy ,TOCSY)是解 析分子结构的常用二维NMR谱,克服谱重叠的另一种方法就是将LED或BPP2LED序列和这些传统 的二维实验相结合,如Gozansky等提出的DOSY2NOESY25或Lin提出的DOSY2TOC
10、SY26,这里DOSY2TOCSY又称为扩散编码谱(diffusion2encoded spectroscopy , DECODES)。除增加了梯度脉冲以 外,这些谱的脉冲序列与对应的二维相关谱很相似。然而,由于脉冲梯度场的应用,谱中每一个交叉峰 的强度依赖于产生该交叉峰的化合物的扩散速率,通过增加梯度脉冲强度而得到的一系列二维谱可估 计某一化合物的扩散系数,若不考虑实验误差,从某一化合物产生的信号应该获得相同的扩散系数。DECODES实验的优势是把一个J2耦合体系的所有1H共振都关联起来,从而允许探讨重叠共振和完全分辨共振的相关情况,这不仅仅简化了分子识别,也为估计分子扩散系数提供了更多的机
11、会,只要某化 合物能够产生一个可分辨的交叉峰,就有可能分析其分子结构并估计扩散系数。 将扩散NMR用于药物筛选即为 “亲和磁共振”27。 亲和磁共振实验条件(即:梯度强度、 持续时间 和延迟)的设定非常重要,所设条件在无受体存在时混合物各成分无信号出现,该条件下加入受体,无结 合作用的化合物在亲和磁共振实验中将不出峰。由于与受体结合的配体扩散速率明显降低,因而它们的信号将出现在亲和磁共振谱图上。 第一个亲和磁共振的研究实例是关于氢化奎宁292菲基醚(hydroquinine292phenanthryl ether)受体与8个可能配体混合物的相互作用28。在正常氢谱中,9种化合物的信号都存在,当
12、配体与受体结合时, 其运动明显变慢。在亲和磁共振实验中采用扩散滤波的方法滤除快扩散成分,只有两种慢运动的与受 体结合的配体和受体本身出现在谱图上,其它所有配体的信号均消失。在和亲和磁共振相同的条件下 进行DECODES实验,辨别出这两种化合物是DL2异柠檬酸内酯(DL2isocitric lactone)和(S)2( + )2O2乙酰基苯乙醇酸(S)2( + )2O2acetylimandelic acid)。 当混合物中有多个配体能与受体结合时,通过DECODES实验或调节受体2配体相对浓度以匹配不 同配体结合能力的方法,这些配体也可以一一得到识别。Lin等27报道了一个调节亲和磁共振实验条
13、 件以匹配配体结合能力的实例,将氢化奎宁292菲基醚加入4种有机酸的混合物,根据其亲和能力,每一3351第11期纪竹生等:药物配体与生物大分子受体相互作用核磁共振的研究进展 种有机酸依次出现在亲和磁共振谱图上。为了将亲和磁共振应用到更具有生理意义的体系中,Lin 等29尝试了对DNA2药物相互作用的研究。采用DECODES方法,在无结合作用的化合物腺嘌呤(adenine)、 腺苷(adenosine)和维生素B1(thiamine)存在的情况下,他们识别出化合物Hoechst 33342与Drew2Dickerson dodecamer d(CGCGAATTCGCG)2的相互作用。DECODE
14、S方法研究DNA片断的优点是DNA谱在芳香区域没有交叉峰,这就大大方便了有芳环的配体信号的识别和解析。他们还研究了 糖肽万古霉素(glycopeptide vancomycin)与10种低聚肽混合物的相互作用30。亲和磁共振研究表明, 两种含D2残基的低聚肽DDFA和DDFS与万古霉素有明显的结合作用。 扩散编辑谱中始终存在受体信号,这可能是亲和磁共振的一个问题。配体信号可能与受体信号重 叠,特别是当受体为一分子量很大的蛋白质的时候。对于小分子受体DECODES是一种有效的解析工具,但该方法很难适用于蛋白受体。为使亲和磁共振的应用扩展到分子量更大的蛋白受体,同位素滤波 亲和磁共振得到了发展31
15、。该实验以13C标记的蛋白质为原料,除使用LED序列外还使用13C滤波步 骤。该序列可同时消除蛋白受体及不与受体作用的化合物的信号。Hajduk等32提出了一种不需要同位素标记蛋白质的方法,该方法依赖于在低梯度和高梯度强度 及受体蛋白存在或不存在情况下所得图谱的差谱,差谱中仅仅显示结合配体信号。同位素滤波PFG实验和差谱方法均成功地应用于大约20kDa的基质酶催化域(stromelysin catalytic domain)的研究。 从以上的讨论中可知,根据扩散系数的相对大小,可以对分子进行谱编辑,使结合配体从它与非结 合分子的混合物中识别出来。但是,研究表明,化学交换对扩散NMR实验中观察到
16、的信号强度有非常 大的影响,弱结合配体” 结合态” 和” 游离态” 的化学交换能够引起严重的信号扭曲,从而造成灵敏度损失 和解析错误。由于能够识别弱结合配体是亲和磁共振的一大优势,因此这一影响无疑极大地限制了亲 和磁共振的应用。例如,使用LED脉冲序列,在含有万古霉素和DDFA的样品中可观察到DDFA信号 的强度调制33。而使用BPP2LED脉冲序列,得到的则是没有这种余弦调制的信号,从而解决了这种由 于交换而产生的问题。因此,在扩散实验中,双极性LED脉冲序列是一种更好的选择,由此序列产生的 谱图没有化学交换调制或其他不良影响。3 NOE抽运( NOE pumping)除了交换调制外,亲和磁共振实验还存在其它问题。由于结合配体通常在游离态和结合态之间进 行交换,扩散系数的观测值(Dobs)是游离态(Dfree)和结合态(Dbound)扩散系数的权重平均值:Dobs=xfreeDfree+xboundDbound式中xfree和xbound分别是游离态和结合态配体的摩尔分数,xfree+xbound= 1。当小配体与大分子结合 时,Dfree可能比D
