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1、天津医科大学硬士学位论文摘要目的：葡萄糖一6 一磷酸酶( 9 1 u c o s e 一6 一p h o s p h a t a s e ，G 一6 一P a s e ) 是糖代谢过程中一个重要的酶，由于它是糖异生和耱原分解的最后一步反应的限速酶，因此其基因表达水平及活性的变化直接影响到内生性糖的输出。事实上，2 型糖尿病的高血糖同肝脏胰岛素抵抗所致肝糖过度输出有着紧密的关系。因此G 一6 一P a s e 是糖尿病治疗的一个潜在靶点。本实验旨在研究栎精，G 一6 一P a s e 的一种新型抑制剂，对该酶基因表达和活性的影响，为进一步探讨利用该酶的抑制剂作为糖尿病的治疗手段提供理论依据和实验
2、基础。方法：以胶原酶原位灌注消化的方法分离大鼠肝细胞，用含1 0 F B S 的1 6 4 0 培养液进行原代培养，利用抗大鼠c K 一1 8 作为一抗，采用免疫组化方法对细胞进行鉴定。待细胞贴壁换用新鲜的含诱导剂和不同浓度抑制剂的培养液培养1 6 小时后：1 ) 提取细胞总R N A ，采用半定量R T P c R 的方法测定G 一6 一p a s e 两个亚基的m R N A 的丰度；2 ) 利用葡萄糖脱氢酶偶联反应测定酶的活性。结果：1 采用以胶原酶原位灌注消化的方法分离的肝细胞产率及活率均比较高。细胞活率可达到8 5 以上。2 免疫组化染色结果呈阳性若色( 有阴性对照) 。3 大鼠肝细
3、胞在高糖培养液( 2 5 删G 1 u ) 中培养1 6 小时后，G 一6 一P a s e催化亚基和转运亚基m R N A 的丰度和酶活性均明显增加。( P p H 至7 6过滤IO 2 2Um过滤4 。C 贮存1 2 1 。C ，4 。C 贮存3 0m i n1 6 4 0 培养液配制：1 ) 将1 6 4 0 培养粉倒入10 0 0m 1 的烧杯中，以超纯水冲洗包装袋3 遍2 ) 向烧杯中加入5 的N a H C O 。溶液4 0m 1 ( 2 Og ) ；3 ) 加超纯水至10 0 0m l ；4 ) 磁力搅拌至粉末完全溶解；5 ) 以1MH C l 调节p H 至7 2 ；6 ) 0
4、 2 2 “m 过滤，分装，4 。C 贮存天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )、，J，水搅机d末叭粉解0 溶盹至拌天津医科大学硕士学位论文1 6 4 0 生长培养液配制( 2 0 0m 1 ) ：1 6 4 0 培养液1 8 0I I l l、r B sz om -IP s1 0 0u ，m l 4 。c 贮存I n s u l i n4 0 u m lJ4 大鼠肝细胞的分离培养4 1 大鼠肝细胞的分离1 ) 雄性w i s t a r 大鼠体重1 8 0g 左右，禁食2 4 小时；2 )以O 3m l 1 0 0 9 剂量腹腔注射1 0 的水合氯醛麻醉；3 ) 以0
5、1 新洁而灭浸泡大鼠3m i n 后将大鼠转移至超净台；4 ) 依次打开大鼠皮肤、腹腔，分离门静脉并插入套管针以动脉夹固定，打开下腔静脉，5 ) 以3 7 。c 预热的H e p e s 缓冲液灌流肝脏，流速2 0m 1 m i n ；6 ) 待肝脏变白改用3 7 。C 预热的0 0 2 胶原酶灌注消化分离肝细胞，流速2 0m l m i n ：7 ) 待看到肝脏表面出现囊泡或者有裂痕时即立刻停止灌注，小心的将肝脏剪下放到盛有H e p e s 缓冲液的烧杯中轻轻冲洗一遍，然后将肝脏转移至另一个盛有适量1 6 4 0 培养液的烧杯中；8 ) 用无菌镊子轻轻撕开肝脏表面的包膜并不断抖动以抖落肝细
6、胞；9 ) 室温静止2 0m i n 后倒掉上清，下层细胞悬液以2 0 0 目的筛网过滤。4 2 大鼠肝细胞的纯化1 ) 取过滤后的肝细胞以10 0 0r p m ，5m i n 离心；2 ) 弃上清，加入1 6 4 0 培养液重新吹打细胞致悬浮后，5 0 0r p m ，5m i n离心：3 ) 弃上清，加入1 6 4 0 培养液重新吹打细胞致悬浮后，8 0 0r p m ，3m i n天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )天津医科大学硕士学位论文离心：4 ) 用生长培养液重悬细胞，以红血球计数板进行细胞计数并以台盼兰染色检测分离细胞的活性；5 ) 调整细胞密度为1 O
7、 1 0 5 个m 1 接种到6 0 姗及3 5 嘲培养皿，置入预处理过的盖玻片以制备细胞爬片。4 3 大鼠肝细胞的培养1 ) 将接种的细胞放入二氧化碳孵箱以3 7 。C ，5 C 0 2 培养；2 ) 细胞培养4 小时后给各组细胞按表1 换液；表1 细胞分组及各组细胞培养液的组成注1G l u葡萄糖( g l u c o s e )注2Q栎精( q u e r c e t i n )3 ) 细胞培养1 6 小时后终止培养，进行肝细胞R N A 的提取或酶活性测定。5 肝细胞的形态学观察倒置光学显微镜，离心前、离心后的肝细胞悬液，接种当时的细胞和培养2 0 小时、4 8 小时、一周、两周的细胞
8、均在相差显微镜下观察细胞形态并拍照。6 肝细胞免疫组化鉴定6 1 一抗小鼠抗大鼠c K 一1 8 单克隆抗体；天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )天津医科大学硕士学位论文6 2 细胞爬片的固定1 ) 取出爬片，用3 7 。c 预热的P B S 缓冲液清洗( 5 珈i n 3 次) ；2 ) 在培养皿中加入冷丙酮固定3 0m i n ：3 ) P B s 缓冲液清洗( 5m i n 3 次) ，晾干后置于一2 00 C 保存。6 。3 染色1 ) 取出爬片恢复到室温后，P B s 缓冲液清洗( 5m i n 3 次) ；2 ) 用H 。O ：室温孵育1 5m i n 以消
9、除内源性过氧化物酶的活性：3 ) P B S 缓冲液清洗( 5m i n 3 次) ：4 ) 5 1 0 正常山羊血清封闭，室温孵育3 0m i n ，倾去血清、勿洗，滴加适当比例稀释的一抗( 1 ：3 0 0 ) ，3 7 。c 孵育lh ，恢复室温后置于4 过夜；5 ) 恢复室温，P B s 缓冲液清洗( 5m i n 3 次) ，滴加二抗工作液，3 7 。c孵育3 0m i n ；6 ) 恢复室温，P B S 缓冲液清洗( 5m i n 3 次) ，滴加三抗工作液，3 7 孵育3 0m i n ；7 ) 恢复室温，P B s 缓冲液清洗( 5m i n 3 次) ；6 4 显色、复染、分
10、化、返蓝、脱水、封片1 ) 显色D A B 显色液配制按照试剂盒程序，滴加适量配制好的显色液，镜下观察着色情况，满以后立即投入d d H 。0 中终止染色，然后d d H 。0冲洗卜2m i n 。2 ) 复染用苏木素复染约4m i n ，自来水冲洗5 1 0m i n ：3 ) 分化0 5 盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗2 5m i n ；4 ) 返蓝O 黝淡氨水蓝化3 0s ，自来水冲洗；5 ) 脱水梯度酒精脱水；6 ) 封片用中性树脂封片。天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )天津医科大学硕士学位论文结果1 制备的肝细胞的形态、产率及活率用上述方法分离制备的肝细胞呈现
11、单个的分散状态，倒置显微镜下细胞透亮，为具有一定立体感的圆形细胞。体重为1 8 0g 左右的大鼠约能收获2 0 3 O1 0 7 个细胞，台盼兰染色检测细胞的活率大于8 5 。图l 离心前( 4 0 0 )图2 离心后( 4 0 0 )天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )在未离心纯化前有许多的杂质，其中主要以红细胞为主( 图1 ) 。离心后细胞中的红细胞明显减少，主要是单一的肝细胞，细胞为球形、圆形，细胞核位于细胞正中，可见双核肝细胞，细胞边界轮廓清晰( 图2 ) 。天津医科大学硕士学位论文2 培养过程中肝细胞的形态学特征培养的肝细胞在接种两小时后就开始贴壁，4 小时后
12、大部分细胞都贴壁，贴壁的细胞开始发生形态改变。圈3 培养2 0h ( 柏0 )圈4 培养4 8h ( 4 0 0 )天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )培养2 0 小时后，可见细胞帖附、伸展、呈圆形、椭圆形及多边形，细胞核体积较大，可见少许多核细胞，细胞浆为颗粒状，部分细胞开始小范围的呈岛状连结。( 图3 )4 8 小时后细胞变化更明显。整个细胞变薄并向四周拉平，细胞形成岛状连结成片，可见许多双核细胞和多核细胞。( 图4 )天津医科大学硕士学位论文图5 培养7d ( 4 0 0 )图6 培养1 4d ( 4 0 0 )培养7 d 后，可以在岛状生长的细胞周围见到少量的新
13、生细胞，新生细胞较小，透亮具有立体感，胞浆与胞核的区别不是很明显( 图5 ) 。培养1 4 d 后，可见大量的新生细胞，也呈岛状生长，细胞透亮极具立体感。老的细胞浆变粗糙，颜色变深，有的胞质开始出现空泡( 图6 ) 。3 免疫组化结果细胞爬片进行s P 染色经D A B 显色阳性着色部位在胞浆呈棕黄色颗粒( 图8 ) ，并做阴性对照( 图7 ) ，苏木素复染核呈蓝色。天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )天津医科大学硕士学位论文圈7 阴性对照( 4 0 0 )图8 阳性结果( 箭头部位为阳性着色部)( x 4 0 0 )天津市自然科学基金( 0 4 3 8 0 9 2 “
14、)1 8天津医科大学硕士学位论文第二部分栎精对肝细胞葡萄糖一6 一磷酸酶催化亚基和转运亚基基因表达的影响P a r tT w OT h eE f f e c to fQ u e r c e t i no nt h eG e n eE x p r e s s i o no fP 3 6a n dP 4 6o fH e p a t o c y t eG l u c o s e - 6 一p h o s p h a t a s e天津市自然科学基金( 0 4 3 6 0 9 2 1 1 )1 9天津医科大学硕士学位论文材料与方法1 实验对象原代培养的大鼠肝细胞2 分子生物学实验2 1 主要试剂2 1
15、 1R N A 提取试剂：T r ir e a g e n t( M R CU s A )D E P C( S i g m aC o ，U S A )2 1 2c D N A 第一条链合成试剂：M M L vR e v e r s eT r a n s c r i p t a s e( 2 0 0u u1 )( P r o m e g aC o ，U S A )M M L v5 x R TR e a c t i o nB u f f e r ( c o n t a i n i n g2 5 0M I I lT r i s H C l ，3 7 5m MK C l ，1 5 l MM g C l
16、 2 ，5 0m lD T T )( P r o m e g aC o ，U S A )R i b o n u c l e a s eI n h i b i t o r( T a k a r aB i o t e c hC o ，L t d )O l i g od T ( T a k a r aB i o t e c hC o ，L t d )T a qD N A 聚合酶( T a k a r aB i o t e c hc o 。L t d )d N T P ( T a k a r aB i o t e c hC o ，L t d )2 1 3P C R 试剂：T a qD N A 聚合酶( T a k a r aB i o t e c hC o ，L t d )1 0 B u f f e r ( c o n t a i n i n g2 0 0m MT r i s
