《紫杉醇对人宫颈癌细胞系hce-2c1-影响的蛋白质组学的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《紫杉醇对人宫颈癌细胞系hce-2c1-影响的蛋白质组学的研究（98页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、博士学位论文中文摘要摘要目的：比较紫杉醇处理前后宫颈癌细胞系H C E l 蛋白表达谱的差异，对差异蛋白质点进行鉴定，从而揭示紫杉醇治疗宫颈癌的作用机制，从中筛选出评价紫杉醇疗效的特异蛋白质和找出新药治疗的靶点。方法：本研究首先用紫杉醇干预人宫颈癌H C E l 细胞，采用M T T比色法检测紫杉醇对宫颈癌细胞增殖的影响，确定紫杉醇对宫颈癌细胞增殖抑制的最佳浓度；通过流式细胞仪分析紫杉醇处理后宫颈癌细胞凋亡和细胞周期的改变，进一步确定紫杉醇抑制宫颈癌细胞的最佳浓度和时间。然后提取紫杉醇最佳浓度、最佳时间作用下宫颈癌H C E l细胞株和对照组的总蛋白质，利用固相p H 梯度( I m m o
2、b i l i z e dp Hg r a d i e n t ，I P G ) 双向凝胶电泳( T w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - D E )分离处理组和对照组的总蛋白质，经考马斯亮蓝染色，图像扫描，获取处理组和对照组总蛋白质的双向凝胶电泳图谱。使用P D Q u e s t 软件对处理组和对照组的2 - D E 图谱进行分析比较，找出差异蛋白质点。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( M a t r i x - a s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o n
3、 i o n i z a t i o nt i m e - - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y , M A L D I - T O FM S ) 进行鉴定，获得蛋白质点的肽质量指纹图谱( P e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ，P M F ) 。运用M a s c o tD i s t i l l e r 软件进行识别，搜索S W I S S P R O T 和N C B I 蛋白质数据库，如果M a s c o t 分数 6 4 分( P 0 0 5 ) 1 0博士学位论文第一章对照
4、组0 0 1p m o b i l 紫杉醇作用2 4 小时组0 0 5p m o l L 紫杉醇作用2 4 小时组0 0 1p m o l L 紫杉醇作用4 8 小时组0 0 5I I m o l L 紫杉醇作用4 B 小时组图1 - 4 紫杉醇作用于人宫颈癌细胞系H C E 。细胞周期变化博士学位论文第一章4 讨论宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。2 0 0 0 年统计数据显示：宫颈癌居全球女性生殖道恶性肿瘤发病率首位，新发病例4 7 万，死亡2 3 万【1 “ r l 。宫颈癌传统的治疗手段是手术和放疗，过去的观点认为子宫颈癌对化疗不敏感。然而手术技巧、放疗技术及设备的改进未能使宫颈癌的治
5、疗效果得到改善。随着对肿瘤发生、发展机制的深入研究，人们逐渐认识到手术和放疗对宫颈癌仅是局部治疗，不能控制肿瘤的亚临床病灶或可能存在的全身亚临床转移灶，因而化疗逐渐得到重视。铂类药物是目前治疗宫颈癌最有效的化疗药物，异环磷酰胺，博莱霉素是治疗宫颈癌另外两种化疗药物，但这些药物治疗效果欠佳，副作用大。为进一步改善宫颈癌的预后，寻找新的有效治疗宫颈癌的药物研究一直在进行中，其中紫杉醇是备受关注的化疗药物之一。紫杉醇在卵巢癌的治疗中积累了大量临床经验，但其用于宫颈癌的治疗仍属探索阶段。紫杉醇治疗宫颈癌概括起来主要包括以下三方面：对于局限性晚期宫颈癌的先期化疗、晚期或复发病例的治疗以及放射治疗的增敏I
6、 l 羽。紫杉醇属细胞毒类化合物，为一抗微管药物。一般认为紫杉醇的主要靶位点是微管蛋白微管系统，它能促进微管聚合，抑制微管降解，使细胞分裂阻滞在G z M 期，最终导致细胞死亡。近年来，许多研究者发现紫杉醇能够诱导多种癌细胞的凋亡，而且大量研究表明紫杉醇对微管系统的作用及对G 2 M 期的阻滞不是诱导细胞凋亡的唯一途径，可能还有其他信号通路参与紫杉醇诱导的细胞凋亡，如R a f - l B c l - 2 磷酸化、C M O S 基因表达、P 5 3 突变等【1 9 1 。抗癌药物对肿瘤产生的效果不仅依赖于对肿瘤细胞增殖的抑制，同时也依赖于诱导肿瘤细胞的凋亡，能否诱导肿瘤细胞凋亡已成为评价抗癌
7、药物疗效的重要标志。由于紫杉醇的诱导细胞凋亡作用，故对多种癌细胞具有显著的疗效。由于它在实体瘤冶疗中的良好疗效，近年来也广泛用于宫颈癌的治疗中。关于紫杉醇对宫颈癌细胞系作用机制的研究，国内已有大量文献报道。李坚等1 2 0 研究紫杉醇对宫颈癌H d a 细胞生长的影响，通过生长曲线、集落形成试验、分裂指数实验观察紫杉醇对H e l a 的影响作用，结论提示紫杉醇对H e l a 细胞的生长有抑制作用；王艾琳【2 1 1 研究紫杉醇抑制H e l a 细胞生长机制，经荧光染色、电1 2博士学位论文第一章镜观察、D N A L a d d e r 及流式细胞仪检测凋亡细胞，发现紫杉醇可诱导细胞凋亡
8、，也可直接杀伤H e l a 细胞，且以后者为主；胡向阳等瞄1 探讨紫杉醇诱导H e l a 细胞凋亡的特点及细胞凋亡的分子机制时得出结论紫杉醇可诱导H e l a 细胞凋亡，H e l a细胞凋亡是C a s p a s e 3 依赖性的；黄泽亮等 2 3 1 研究紫杉醇对H e l a 细胞作用时发现紫杉醇的诱导H e l a 细胞凋亡的同时抑制端粒酶的活性，且b e l - 2 参与紫杉醇的诱导细胞凋亡中端粒酶活性的调控。细胞凋亡是细胞受到一系列细胞代谢的改变而发生的细胞死亡，是一种由基因控制的细胞自杀性死亡过程，不引起炎症反应。凋亡和细胞病理性坏死是两个概念，两者的区别在于凋亡的细胞体
9、积变小，皱缩变圆，细胞的缩小使细胞间距离增大，细胞相互脱离，胞核固缩，染色体浓缩致密，胞膜皱缩但完整，胞浆密度升高，胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体。本实验发现紫杉醇作用于宫颈癌H C E l 细胞后，细胞即出现上述形态学改变，即呈现典型的凋亡改变。本研究通过M T T 法测定紫杉醇对宫颈癌细胞生长的抑制作用，发现随着紫杉醇浓度的加大和作用时间的延长，细胞存活率逐渐下降，O 1 l a m o l L 浓度组药物作用9 6 小时后细胞几乎全部被杀死。表明紫杉醇对宫颈癌细胞的杀灭作用呈时间和剂量依赖关系。结果提示临床工作中应在控制药物的不良反应的前提下，相对时间内尽可能提高血药浓度
10、以增强紫杉醇对癌细胞的杀灭作用，同时也提示紫杉醇2 4 小时持续给药效果优于3 小时冲击疗法。紫杉醇是细胞阻断剂，能够诱导多种癌细胞的凋亡，它的抗癌效果与其诱导细胞凋亡的能力密切相关。至于紫杉醇诱导细胞凋亡的机理目前尚不完全清楚，多数认为抗凋亡蛋白b c l - 2 的磷酸化似乎起关键性的作用 2 4 1 。本研究通过流式细胞仪检测发现，随着紫杉醇浓度的增加及作用时间的延长，癌细胞的凋亡率逐渐增加，O 0 5 1 x m o l L 浓度组作用7 2 小时后细胞凋亡率超过5 0 ，这与黄泽亮等 z 3 1的研究结果一致。D N A 是细胞内的遗传物质，细胞周期各时相D N A 含量呈规律性变化
11、，D N A含量的变化代表细胞的生长代谢、分裂和遗传情况，是衡量细胞生命活动的重要指标，检测D N A 含量对研究细胞周期具有重要意义。细胞周期包括间期和分裂期( M ) 两部分，间期又分为G l 期、S 期和G 2 期。G 2 M 期是细胞周期的两个检查点之一，是细胞增殖的重要阶段。多种D N A 损伤剂( 射线、化学药物等)博士学位论文第一章均可引起G 2 ，M 期阻滞，由于G 2 M 期阻滞在细胞增殖和凋亡中的作用，因此G 2 ，M期阻滞与多种肿瘤的发生、发展关系密切【2 5 1 。紫杉醇作用的靶是细胞骨架的微管系统，促进微管聚合并稳定微管结构，阻止其解聚成亚单位，进而影响微管聚合与解聚
12、的动态平衡，导致细胞周期阻滞在G 2 M 期 2 6 1 。陈荣丽等1 2 7 研究紫杉醇对乳腺癌细胞凋亡的机制时发现，紫杉醇作用后G d M 期细胞百分比明显增高，出现G J M 期阻滞。何松等圆在紫杉醇对肝癌细胞生长抑制的研究中发现，紫杉醇处理细胞后，细胞明显阻滞在G 2 M 期，该期细胞占7 3 5 。余志英等 2 9 1 在研究紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡及细胞周期改变时发现，随着药物作用时间的延长6 z M 期阻滞逐渐明显，但即使G M 期阻滞达到高峰时，也不出现明显凋亡现象，但在G 2 M 期阻滞高峰后才出现明显凋亡现象，说明紫杉醇作用于卵巢癌细胞是先出现G z M 期阻滞再出现细胞凋
13、亡的。本研究通过流式细胞仪检测紫杉醇作用于人宫颈癌H C E I 细胞后细胞周期的变化，发现O 0 1 1 t m o l L 组在二个时间段( 2 4 h r 、4 8 h r ) 均没有引起细胞出现G z I v l 期阻滞，但能引起细胞凋亡；0 0 5 1 t m 0 1 L组在药物作用2 4 小时出现G 2 M 期阻滞，但随着药物作用时间的延长，G 2 ，M 期阻滞作用逐渐消失，而此时细胞凋亡率却很高。可能的解释是低剂量紫杉醇作用于宫颈癌细胞只出现凋亡而不引起G 2 M 期阻滞，这与L i n 等【3 0 】在研究小剂量泰素( 1 0 n m o l L ) 作用于胃癌细胞时得出的结论
14、一致。高浓度组( O 0 5 1 t m o F L ) 紫杉醇作用于宫颈癌细胞2 4 h r 时G d M 期阻滞作用明显，此时凋亡率不高，随着作用时间的延长，G 2 M 期阻滞作用减弱而凋亡率逐渐升高，这一结果与余志英等四】的研究结果一致，说明紫杉醇作用于人宫颈癌H C E l 细胞先出现G 2 ，M 期阻滞之后才出现细胞凋亡。综上所述，高浓度( O 0 5 p m o l L ) 紫杉醇能引起宫颈癌细胞系H C E l 细胞的凋亡和G z M 期阻滞，药物作用后首先出现G 2 ，M 期阻滞，随后才出现细胞凋亡。O 0 5 0 m o l L 紫杉醇作用细胞2 4 小时时，细胞凋亡与G z
15、 M 期阻滞均明显，故选择0 0 5 1 a n o l L 紫杉醇干预H C E l 细胞2 4 小时来进行后续蛋白质组学分析。1 4博士学位论文第一章5 结论( 1 ) 紫杉醇对人宫颈癌细胞系H C E l 细胞的增殖具有抑制作用，且随药物浓度增加和作用时间延长，抑制作用越明显。( 2 ) 低浓度( O 0 1 肛m o l L ) 紫杉醇只影响宫颈癌细胞的凋亡率，不影响细胞周期。( 3 ) 高浓度( O 0 5 斗m o l L ) 紫杉醇既影响宫颈癌细胞的凋亡率又影响细胞周期，主要是引起G 2 期细胞增加。博士学位论文第二章第二章紫杉醇对人宫颈癌细胞系H C E ，蛋白质双向电泳表达谱
16、的影响以及部分差异表达蛋白质的质谱分析l 引言以往研究一种药物对某种癌细胞的影响多是从基因水平进行研究，即通过比较该种药物作用前后癌细胞差异基因表达情况来阐明药物的作用机制。在蛋白质水平上多采用免疫组化、免疫印迹法和流式细胞仪间接免疫荧光技术，这些方法局限于研究一种或几种蛋白质的表达，研究结果的信息量也十分有限。近年来随着蛋白质组学在肿瘤研究中的广泛应用，人们可以直接从生物功能的执行者一蛋白质入手，从整体上，全面地、动态地、定量地分析比较正常及病变标本中蛋白质种类和数量的改变，有助于阐明蛋白质问的调控网络，深化肿瘤发病机制的认识，发现肿瘤诊断、治疗和预后的特异性标志物，加快肿瘤疫苗的研制和新药的开发。蛋白质组学研究现已在人类多种肿瘤组织或细胞中开展，并取得了一些成果。国内外有关宫颈癌的蛋白质组学研究也有一些报道，但运用蛋白质组学技术来研究紫杉醇对宫颈癌细胞的影响，国内外文献极少。在本研究的第一部分实验中，通过M T T 实验及流式细胞仪检测发现0
