生物科学与生物技术专业本科

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1、生物科学与生物技术专业本科生物科学与生物技术专业本科 实验技能导论- 生物技术实验器材基本原理及应用实验技能导论- 生物技术实验器材基本原理及应用第4章 光学显微镜及以光镜为基础的显微分析仪器第4章 光学显微镜及以光镜为基础的显微分析仪器 第第3节光学显微镜镜像记录技术节光学显微镜镜像记录技术显微摄影技术显微摄影技术(PHOTOMICROGRAPHY)授课教师： 崔泽实授课教师： 崔泽实显微摄影技术定义显微摄影技术定义 将显微镜视场中的微观镜像记录为放大图像将显微镜视场中的微观镜像记录为放大图像 的技术。的技术。 本节主要内容 本节主要内容1. 显微摄影装置显微摄影装置 2. 环境要求环境要求

2、 3. 必要硬件的选择必要硬件的选择 4. 基本操作步骤基本操作步骤1. 显微摄影装置显微摄影装置1.1种类：种类：胶片尺寸胶片尺寸(帧幅帧幅)：35mm， 16mm(连摄连摄)； 120mm, 4 5英寸英寸(9 11.5cm)，6 9英寸英寸 大片拍摄技术难，但图像优于大片拍摄技术难，但图像优于35mm, 适于再放大。适于再放大。控制方式： 全自动、半自动、手动控制方式： 全自动、半自动、手动全自动显微摄影装置应具备：胶片规格选择、测光 面积选择、色温测定、感光度设 置、倒易率失效补 偿、曝光方式控制、数 据影印等功能。全自动显微摄影装置应具备：胶片规格选择、测光 面积选择、色温测定、感光

3、度设 置、倒易率失效补 偿、曝光方式控制、数 据影印等功能。1.2 全自动显微摄影装置及相关必备器材全自动显微摄影装置及相关必备器材2. 环境等辅助要求环境等辅助要求 无尘。无尘。 无振动。无振动。 避免强光照射避免强光照射 - 影响对焦准确性。影响对焦准确性。 房间照度不能过强，散射光、照明的眩光透过目 镜会反射到底片上，干扰正常感光房间照度不能过强，散射光、照明的眩光透过目 镜会反射到底片上，干扰正常感光 无腐蚀性气、物。无腐蚀性气、物。 防潮、防霉。防潮、防霉。3. 必要硬件的选择及调置必要硬件的选择及调置胶片（胶片（Films） 摄影目镜（摄影目镜（Photo Eyepiece） 物镜

4、（物镜（Objectives） 聚光镜（聚光镜（Condensors） 滤光片（滤光片（Filters）3.1 胶片的选择胶片的选择BF：追求分辨率、色彩还原，首选：追求分辨率、色彩还原，首选 ISO100, 甚至更低甚至更低FL: 追求敏感度，选追求敏感度，选ISO4003.2摄影目镜的选择摄影目镜的选择在光学显微镜的有效放大倍率内，尽量 优选低倍摄影目镜与物镜搭配。在光学显微镜的有效放大倍率内，尽量 优选低倍摄影目镜与物镜搭配。注意与不同的光学系统在型号上相对注意与不同的光学系统在型号上相对 应。例如：应。例如： OLYMPUS： BH/AH/IM系列系列 - NFK BX/AX/IX 系

5、列系列 - PE摄影目镜配置-遵循有效放大原则摄影目镜配置-遵循有效放大原则不同摄影目镜/物镜组合的效果不同摄影目镜/物镜组合的效果遵循有效放大原则遵循有效放大原则： EM= NA Obj 5501000物镜物镜4 10 40 100 物镜物镜NA 0.130.16 0.300.40 0.700.95 1.251.30有效有效M 65160 150400 350950 62513003.3 选用物镜的基本要求选用物镜的基本要求等级等级：平场消色差：平场消色差 Plan Ach 特殊观察法特殊观察法 - 专用物镜专用物镜 荧光：荧光：B、G激发可用激发可用 Plan Ach 可与可与DIC物镜或

6、物镜或FLUOR/PHASE互用互用 N.A值值：为获得较好焦深、对比度，：为获得较好焦深、对比度，40 ，可稍小 些，或选用带光阑调节的物镜 ，可稍小 些，或选用带光阑调节的物镜(暗场、荧光暗场、荧光) 覆盖差覆盖差：盖玻片 ：盖玻片 0.3mm(S=0.17), 可选用装有校正 环的物镜。可选用装有校正 环的物镜。涂片涂片： NC物镜。物镜。3.4 聚光镜的选择聚光镜的选择等级：平场消色差等级：平场消色差 Plan Ach 与低倍物镜的对应：与低倍物镜的对应： 4 摇出式或超低 倍率聚光镜。 摇出式或超低 倍率聚光镜。 必须要带必须要带NA值调设标线。值调设标线。3.5 滤光片的选择滤光片

7、的选择据胶片类型要求，转换色温 色温平衡据胶片类型要求，转换色温 色温平衡(转换转换)滤光片滤光片 (1)光源色温转换光源色温转换/胶片 光源色温胶片 光源色温: 2800K(钨钨)3400K (卤素卤素) 灯光型灯光型(LBT TUNGSTEN)3400 日光型日光型(LBD， DAYLIGHT5500(2)色补偿滤光片色补偿滤光片(CC) 镜像中的某种偏色可用其互镜像中的某种偏色可用其互 补色消除：补色消除： 利用光的原色及补色利用光的原色及补色黑体辐射色温补偿滤光片色温补偿滤光片显微照像常用的几种滤光片：显微照像常用的几种滤光片： 吸热滤光片：防止对强热辐射对精密镀膜的损 坏。吸热滤光片

8、：防止对强热辐射对精密镀膜的损 坏。 乳白滤光片：强光，使光线变柔和，调灯丝。乳白滤光片：强光，使光线变柔和，调灯丝。 蓝滤光片：色温补偿，纠正背景偏黄蓝滤光片：色温补偿，纠正背景偏黄 青色滤光片：纠正背景橙黄青色滤光片：纠正背景橙黄(酶化学染色酶化学染色) 绿色滤光片：绿色滤光片：(1)纠正物镜象差缺陷，增加绿色波 长，使物镜色差纠正到最佳；纠正物镜象差缺陷，增加绿色波 长，使物镜色差纠正到最佳；(2)HE对绿色吸收能 力强，增加反差。对绿色吸收能 力强，增加反差。 中性密度滤光片：按中性密度滤光片：按%吸收光强，并不影响色温吸收光强，并不影响色温 特殊目的滤光片：酶染色，抗原特殊目的滤光片

9、：酶染色，抗原-抗体反应抗体反应 钕镨滤光片：增强红色钕镨滤光片：增强红色特种滤光片特种滤光片黑白摄影滤光片的选择黑白摄影滤光片的选择标本颜色滤光片色标本颜色滤光片色红红/黄绿黄绿 黄黄/橙蓝橙蓝 蓝橙蓝橙4. 操作步骤及调节操作步骤及调节-以全自动摄影为例以全自动摄影为例4.1选定条件、清理光路选定条件、清理光路(相关部位相关部位)。 4.2调整光轴中心调整光轴中心 - 灯丝对中、聚光镜对中灯丝对中、聚光镜对中 4.3安装胶卷，根据胶卷规格设定以下参数：安装胶卷，根据胶卷规格设定以下参数： 感光度感光度(ISO/ASA/GB/DIN) 选择倒易律失效补偿指数选择倒易律失效补偿指数 对通常使用

10、胶片的感光乳剂，曝光有一定规律对通常使用胶片的感光乳剂，曝光有一定规律 (倒易定律倒易定律)，即曝光是以投射到感光片上的光亮度，即曝光是以投射到感光片上的光亮度 决定，曝光量决定，曝光量=光强 时间光强 时间(互变的直线关系互变的直线关系)。如。如 光圈小可通过延长曝光时间来补偿，取得相同等底光圈小可通过延长曝光时间来补偿，取得相同等底 片密度水平。片密度水平。 但超长时间补偿，该规律不起作用但超长时间补偿，该规律不起作用 - 失效失效 导致曝光不足及彩色还原不良。导致曝光不足及彩色还原不良。(高倍、荧光高倍、荧光)续 倒易律失效补偿续 倒易律失效补偿显微照像不能一味追求缩小聚光镜孔径光阑，显

11、微照像不能一味追求缩小聚光镜孔径光阑，只有延长或缩短曝光时间，才能获得适当的底片只有延长或缩短曝光时间，才能获得适当的底片 曝光密度。曝光密度。 在自动照像控制装置上有倒易率失效钮，可根在自动照像控制装置上有倒易率失效钮，可根 据不同胶片给定的倒易率失效系数来设置，在进据不同胶片给定的倒易率失效系数来设置，在进 行曝光，就可自动补偿，获得合适的曝光效果。行曝光，就可自动补偿，获得合适的曝光效果。 若颜色还原不佳，还可加彩色补偿滤光片纠正。若颜色还原不佳，还可加彩色补偿滤光片纠正。常用胶片补偿值对应表常用胶片补偿值对应表- 标准标准“4”倒易率补偿倒易率补偿Reciprocity (曝光量投射到

12、胶片的照度 曝光时间）曝光量投射到胶片的照度 曝光时间）倒易率补偿的作用倒易率补偿的作用不补偿不补偿补偿补偿1sec4.4放置标本：放置标本： 标本薄厚均匀，减少覆盖差标本薄厚均匀，减少覆盖差 无尘、无手印、无倾斜。无尘、无手印、无倾斜。 4.5设置色温：使用设置色温：使用CTR色温计色温计 选择载玻片的空白无色区域，据胶片类型选选择载玻片的空白无色区域，据胶片类型选 择择“D”或或“T”对准色温计的定位标记对准色温计的定位标记“?”，调整光，调整光 源强度，使色温显示光标与源强度，使色温显示光标与“?”对应。对应。 色温：辐射黑体在一定温度范围内所发射出光色温：辐射黑体在一定温度范围内所发射

13、出光 色，用色，用K表示。表示。 显微镜光源显微镜光源(钨卤丝灯钨卤丝灯)- 28003400 K 多用：日光型胶片多用：日光型胶片- 55006000 K 需用色平衡滤片需用色平衡滤片(LBD)将钨灯色温转为阳光色将钨灯色温转为阳光色 温。温。 灯光型胶片为灯光型胶片为3200 K。LBT4.6 设置曝光补偿调节设置曝光补偿调节EXPOSURE ADJUSTMENT根据拍摄物象的发布所占画面的根据拍摄物象的发布所占画面的%确定：确定： A.如呈均匀发布，用如呈均匀发布，用30%测光范围，则不必补偿，测光范围，则不必补偿， 设设“1” 位。位。 下述需在下述需在1%点测光的情况下调节：点测光的

14、情况下调节： B.如如BF下星状稀散态分布下星状稀散态分布(层次不很清层次不很清)，且物象较，且物象较 暗，设暗，设“0.25”。 C.BF中分布的物象，设中分布的物象，设“0.5”。 D.暗场中分布的物象，设暗场中分布的物象，设“2”。 E.暗场中分布的散在物象，设暗场中分布的散在物象，设“4”。曝光补偿的效果曝光补偿的效果4.7将要拍摄的物象移至视场中间，调焦清楚。瞳距、屈光舒服。将要拍摄的物象移至视场中间，调焦清楚。瞳距、屈光舒服。4.8调节聚光镜调节聚光镜N.A与物镜与物镜N.A的对应比率的对应比率(60%80%), 见附图。见附图。4.9放大象调焦：放大象调焦：- 将拟拍摄物象移至取

15、景框将拟拍摄物象移至取景框-双十字线中间圆点或以双十字线中间圆点或以此为中心设置拍摄范围。拍摄范围可在取景框的范此为中心设置拍摄范围。拍摄范围可在取景框的范围内依据照像物镜的倍率确定。围内依据照像物镜的倍率确定。取景范围的确定取景范围的确定使用调焦望远镜的原则使用调焦望远镜的原则旋拧调焦望远镜的调节帽，使双十字线平行旋拧调焦望远镜的调节帽，使双十字线平行 分开，线条清晰；分开，线条清晰； 同时再用微螺旋调焦物象清晰；同时再用微螺旋调焦物象清晰； 使用使用20X以上倍率物镜时，调节调焦放大镜以上倍率物镜时，调节调焦放大镜 与调焦物象可同步进行。与调焦物象可同步进行。 这样，取景框与物象就在同一个平面上了。这样，取景框与物象就在同一个平面上了。 4X物镜，加调焦放大镜调焦。物镜，加调焦放大镜调焦。拍摄荧光物象拍摄荧光物象 :双十字线处荧光区域，动作双十字线处荧光区域，动作 要快。最好配置带刻线照明的取景放大镜要快。最好配置带刻线照明的取景放大镜调焦望远镜对焦调节调焦望远镜对焦调节4.10 视场光阑的配合使用视场光阑的配合使用-根据不同倍率物镜给予不同直径的光根据不同倍率物镜给予不同直径的光 束；束； -避免散射，增加镜像反差避免散射，增加镜像反差适度：视场光阑象恰在取景框的外缘。适度：视场光阑象恰在取景框的外缘。 过于接近