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1、1河北科技大学生物科学与工程学院 河 北 省 发 酵 工 程 技 术 研 究 中 心 徐亲民2009年9月初稿， 2010年9月第一次修改，2012年7月第二次修改。2 2水分在冰冻状态下直接升华而干燥水分在冰冻状态下直接升华而干燥冷冻干燥的三要素：冷冻干燥的三要素：真空降低水的蒸汽压以加速水分的蒸发冷冻使水蒸气冷凝以减轻真空泵负荷,加速干燥温度达到进一步加速干燥的目的冷冻干燥的优点：冷冻干燥的优点：对微生物的生物活性影响小所得干粉疏松，溶解性好干燥后水分含量低由于同时满足干燥和真空两个菌保要素,因而保存时间长,保存过程不易失活和退化3 3取质地均匀、厚实(壁厚0.71 mm)、无毛点、无气泡
2、的硬质玻璃专用菌种冷冻管（图1），清洗干净后在管内放置打印有菌种简略名称和编号的纸条标签（图1左边的单管式冷冻管置于熔封区和装液区之间，右边的套管式冷冻管置于内外管之间），单管式冷冻管管口和套管式冷冻管内管管口插入疏松的棉塞，用牛皮纸包裹，于121灭菌30分钟，取出置37孵育24小时，重复灭菌一次，105110烤干（有硅胶指示剂的要使硅胶达到亮蓝色），置干燥器内备用。4 4推荐尺寸：(左) 8100，璧厚0.81 mm，球径12 mm；(中、右) 外管12100，璧厚0.70.8 mm；内管950，壁厚0.5 mm。棉塞熔封区放标签处装液区外管熔封区棉塞内管放标签处变色硅胶棉塞5 5取市售新鲜
3、、清洁、无抗生素污染的牛奶200 g，在5000 r/min下离心10分钟，除去上层奶皮，如此重复两次。然后分装入两个250 ml锥形瓶中，加棉塞并用牛皮纸包头、扎牢，在115下灭菌15分钟，冷却后备用。如灭菌后放置时间超过24小时，则应弃用。也可以购买袋装或盒装的超高温灭菌优质脱脂牛奶直接使用，无需再灭菌。或将脱脂奶粉制成还原乳，同上灭菌后使用。6 6选生长饱满且无菌检查合格的新鲜菌种斜面或米孢子，加入适量灭菌脱脂牛奶(一般每支中试管斜面加10 ml脱脂牛奶，或每10 ml脱脂牛奶中加1 g 米孢子粒)，用自制接种耳(图2)将斜面上的菌苔轻轻刮下(注意不要刮坏琼脂表面)，或在强力振荡器上将米
4、孢子粒上的孢子震落，摇匀，用灭菌吸管或长针注射器吸出牛奶菌悬液，置于预先灭菌的空试管内。以上操作应在无菌室内的超净工作台上进行。7 7不锈钢丝木柄玻璃毛滴管橡皮头8 8将牛奶菌悬液用长针注射器或长嘴毛滴管(图2)分装入灭菌冷冻管内(注意不要使牛奶玷污纸条标签)，视冷冻管的大小每只0.30.5 ml (单管式冷冻管球形装液区内的装液量应为球体积的一半左右，套管式冷冻管内管的装液高度与管直径相当)，取出棉签棒，留置棉花，置于冷冻干燥机内冷冻干燥24小时左右。冷冻干燥机要先开机预冷30分钟以上再开泵。根据设备情况，有的在冷冻干燥前还要先用液氮或干冰对菌悬液进行预冻。另外，要根据冷冻干燥机的水分蒸发能
5、力，确定一次放入的冷冻管数量。9 9确认菌悬液是否已经干燥的方法是一看真空度，二看冷冻室温度，三看变色硅胶颜色。当水分已经蒸发完，即水蒸汽分压接近零时，真空度将达到最高值而不再上升；由于蒸发是一个吸热过程，在整个冷冻干燥过程中冷冻室的温度将会维持很低，使菌悬液一直处于冻结状态，当没有水分的继续蒸发后，冷冻室不再吸热，温度开始自然上升。确认干燥后，要先开启冷冻室的进气阀，让真空释放，然后停泵，打开冷冻室，将冷冻干燥管取出。为了确保冷冻干燥管内的菌粉不被污染，在冷冻室进气口应装有空气过滤器。1010用自制简易冷冻干燥机进行冷冻干燥管的冷冻干燥，效果优于外购冷冻干燥机。制作方法如下：自制两只1升左右
6、的不锈钢缸子，一只作为真空冷冻干燥室，另一只作为冷凝室，在两个缸子的齐口处焊接宽边不锈钢圈，上面有一只能连接真空泵的加厚透明有机玻璃盖(便于观察内部)，用硅橡胶圈使缸子与缸盖密封。另外买一只35升的广口不锈钢真空保温桶，作为液氮罐(最好是专用液氮罐) ，其口径应能使上述冷凝室缸子插入保温桶，而钢圈架在桶沿上 (图3和图4)。1111至真空泵真空保温桶(液氮罐)液氮冷冻真空室 (放冷冻干燥管)硅橡胶密封圈进气阀 冷凝室厚壁软管真空表温度表1212至真空泵真空保温桶(液氮罐)液氮冷冻真空室 (放冷冻干燥管) 硅橡胶密封圈进气阀冷凝室温度表注：冷冻真空室夏天由室温加热，冬天可在外壁缠绕加热带，控温3
7、040。真空表1313操作前，将冷冻干燥室和冷凝室清洗干净，控干后用酒精棉擦拭冷冻干燥室内腔，然后在顶盖上的进气管内塞入棉花，关闭进气阀门，连接好真空管线。在冷凝室加入小半缸液氮，把装有待冷冻干燥样品的冷冻干燥管放入冷凝室内预冻1015分钟，同时也对冷凝室起到冷却作用。将冷凝室内预冻好的冷冻干燥管移入冷冻室，剩余液氮倒入35升广口液氮罐或真空保温桶内，并补充加入液氮至约2/3高度，立即将冷凝室插入其中，关闭冷冻室进气阀，开启真空泵。1414密切观察冷冻室真空和温度变化情况，若真空度达不到要求(应达到-0.1 MPa)或温度上升至20以上，则应停泵，检查密封度并在冷凝室内补充液氮，问题解决后再重
8、启真空泵(如这一时间过长，则应重新对冷冻干燥管进行预冻)。真空泵运转大约1420小时，确认冷冻管内菌悬液干燥后(变色硅胶呈亮绿色，如未达到要求，可对冷冻室加温至不超过35)，缓慢开启冷冻干燥室的进气阀，释放真空，关真空泵，取出冷冻干燥管进行真空熔封。15简易冷冻干燥机操作成败的关键简易冷冻干燥机操作成败的关键冷冻干燥管中的棉花不能塞得太紧，以蓬松为宜，否则将阻碍水分的蒸发，以致维持不了菌悬液的冰冻状态。室温不能过高，一般不能高于25，否则冰冻的菌悬液易融化。冷冻干燥管必须预冻，使菌悬液处于结实的冰冻状态，在冻干过程中不致融化。冷凝室插入液氮罐时将造成液氮的大量蒸发，所以在抽真空前必须补充足够的
9、液氮。如果在冷冻干燥过程中液氮液位下降过快，还要及时补充液氮。16简易冷冻干燥机的其它用途简易冷冻干燥机的其它用途这一简易冷冻干燥机也可用于其他生物样品以及对热或对氧不稳定的水溶性化学和生化样品的冻干，操作步骤同上。1717利用一边抽真空一边旋转的安瓿真空封口机，可以高质量地将冷冻干燥后的菌种管真空封口。这种安瓿真空封口机如图6所示。操作步骤如下：1. 将燃气瓶上的燃气软管与燃气连接口连接（设备后面混合三通右下方针型调节阀连接口）2. 将待熔封的安瓿插入安瓿夹具（配重夹具），轻轻旋紧螺旋夹，加上适当重量的配重砝码。3. 调节真空头的高度，使其与安瓿口的距离约25 mm。真空熔封（一）真空熔封（
10、一）18184. 抬高安瓿和配重夹具，使安瓿口与真空头相连。5. 插好电源插头，开启电源开关，真空泵和带动真空头旋转的单相电机同时启动。6. 开启真空转换开关，使真空与安瓿连通，安瓿在旋转状态下抽真空。7.转动燃气喷头使其离开安瓿，慢慢地开启燃气针型阀，用打火机点燃燃气。8.开启气泵开关，分别调节空气调节阀和燃气调节阀使火焰大小适中并呈蓝色。真空熔封（二）真空熔封（二）19199.调节燃气喷头的位置，使两束火焰尖头指向安瓿熔封位置。10.火焰很快将安瓿烧软，并在配重夹具重力的作用下拉伸，同时在真空的作用下收缩，最终完全熔封并被拉断，从而完成自动熔封过程。11.将熔封后的安瓿从夹具上取下，把熔封
11、拉断处的尖头置于火焰上烧圆并退火。12.关闭真空转换开关，切断真空与安瓿的连通，用镊子取下真空头上的安瓿残端，插上新的安瓿，开始第二轮熔封。真空熔封（三）真空熔封（三）2020212122221. 立式机使用配重砝码的重量以在旋转抽真空状态下安瓿不从真空吸头上脱落为限；2. 卧式机安瓿口与真空吸头的距离以安瓿夹牢后所能拉伸的距离为限，大约为30-40 mm。3. 如果安瓿口太小，不能将真空头插入，可在安瓿口上套一根20 mm左右长的硅胶管，再与真空头连接；4. 手持燃气喷灯应使高温焰对准熔封部位，并随着安瓿的拉伸向安瓿端移动，以免安瓿端拉丝过长熔封后容易碰断；23235. 燃气喷灯的点火、调温
12、、熄火、充气操作应严格按喷灯所附说明书进行；6.熔封好的安瓿不能倒放在冰凉的桌面上，以免骤冷爆裂，应当插入特制的安瓿架；7.千万不要用手去取下真空头上的安瓿残端，以免烫伤；8.工作结束后关闭燃气喷灯，放在安全并远离火源的地方。2424外观检查：外观检查：冷冻干燥结束后，冷冻管内干燥物成疏松的固体团块，体积应保持与原液体体积相同，而且在长时间保存后不收缩，变色硅胶呈深蓝色。另外，每个月还要对冷冻干燥管定期检查一次，如发现硅胶蓝色变淡、变红，干燥菌粉吸潮收缩，则应予以淘汰，不能继续保存。真空度检查：真空度检查：电火花真空枪检查可见淡蓝色电火花通过真空区，则真空合格，如为紫红色，则不合格。生产能力检查：生产能力检查：每年抽取一只冷冻干燥管，接种斜面、摇瓶，进行生产能力试验，如发现生产能力明显下降，则应进行分离复壮，挑选高产菌株重新制备冷冻干燥管。
