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1、实训 10 花卉的组织培养（综合性实验） 实训 10 花卉的组织培养（综合性实验） 背 景 知 识 背 景 知 识 植物细胞的全能性是指植物体的每个具有完整细胞核的细胞，都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的潜在能力。植物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，具有发育成为完整个体所必需的全部基因。植物细胞潜在全能性的原因是基因表达的选择性。植物体的每一个活细胞都应该具有全能性。从一个受精卵产生具有完整形态和结构机能的植株，这是全能性，是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。同样，植物的体细胞，也是从合子的有丝分裂产生的，也具全能性，具备着遗传信息的传递、转录和翻译的能力。植株
2、上某部分的体细胞只表现一定的形态，承受一定功能，这是由于它们受到自身遗传物质的影响以及具体器官或组织所在环境的束缚，致使植株中不同部位的细胞仅表现出一定形态和功能。但其遗传潜力并没有丧失。一旦脱离原来所在的器官或组织，成为离体状态时，在一定的营养、激素和外界条件的作用下，就可能表现出全能性，而生长发育成完整的植株。因此，每一个新形成的细胞都具有广阔的发育前景，它们能向不同的方向分化、发育，这取决于它们周围的物理、化学因素和空间的影响。在分化和发育过程中，一些基因“开启”，一些基因“关闭”，因此成熟细胞的性质取决于活化的基因组合。一个细胞一旦沿某一条特定的途径分化发育后，它一般不再回复到未分化的
3、状态，但在组织培养和某些特定的环境条件下，可能发生脱分化和再分化，最终形成完整植株。 一、实训目的 一、实训目的 通过组织培养实验，初步掌握组培快速繁殖的方法。重点掌握组培过程中无菌接种技术，了解培养基的组成和配制方法。 二、原理 二、原理 植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。 三、材料及用具三、材料及用具
4、 （一）植物材料 （一）植物材料 花卉植物的茎尖、茎段 （二）药品 （二）药品 1.MS 培养基母液：每配一升培养基需大量元素 100ml（10 倍母液），微量元素 100ml（100 倍母液） 2.植物激素 6-BA0.5mg/L，NAA0.05mg/L 3.琼脂 0.8%，蔗糖 3%，0.1N NaOH，0.1N HCl 4.75%酒清，85%酒精，无菌水，棉球。 （三）用具 三）用具 烧杯 500ml 二个，吸管若干，橡片吸球一个，三角瓶、封口膜、线绳、无菌水瓶、标签纸、漏斗若干、剪刀、解剖刀、大、小镊子各一把，无菌滤纸数张，无菌烧杯若干个，废液缸一个，酒清灯。 四、实验步骤四、实验步骤
5、 （一）培养基（诱芽）的配制 （一）培养基（诱芽）的配制 每组 500ml，培养基成分 MS+BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖3%+琼脂 0.8%，pH5.7-6.0。 1.称琼脂 4g 于 500ml 烧杯中，加蒸馏水约 300ml 溶化； 2.吸加 MS 母液成分： 大量元素 50ml，微量元素 5ml，有机成分 5ml，铁盐 2.5ml，激素 6-BA2ml， NAA1ml， 蔗糖 15g 于另一烧杯中， 加蒸馏水约 100ml加热。 3.溶解好的琼脂、 过滤后的上清液与含MS母液的热溶液混合，用量筒定容至 500ml。 4.用 0.1N NaOH 调 pH 至 5.7-
6、6.0。 5.用漏斗分装培养基，每三角瓶内装培养基 15-20ml。 6.封口、捆扎、贴标签。 标签的上排写明培养基代号、组号；下排留空，接种后写上品种、接种日期、接种人。 （二）培养基的灭菌 （二）培养基的灭菌 1.加水至灭菌锅吃水线，放入装好培养基瓶及其器具的内锅（培养基瓶、无菌水瓶、小烧杯、剪子、镊子、解剖刀等），内锅上盖几张报纸，以防水气弄湿器具，再对角旋紧灭菌锅。 2.加热升压至 0.5kg/cm2时，轻轻打开放气阀排汽，待气压指针退至 0 时关阀门，如此连续三次排气。 3.加温升压至 1.0kg/cm2时，保压（0.9-1.1kg 之间）灭菌 20分钟。 4.保压后，轻轻打开放气阀
7、放气或停止加热，待气压退到0.5kg/cm2时再放气。 5.放气完毕，迅速取出装有培养瓶的内锅。 6.乘热取出三角瓶，平放冷却凝固。 7.将无菌烧杯、剪刀、镊子、灭菌滤纸等放入烘箱中烘干、备用。 （三）芽的诱导 （三）芽的诱导 1.外植体：在大田和盆花中切取 3-6cm 的茎尖部分。 2.表面消毒： 第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自
8、来水冲净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。当然，最理想的清洗物质是表面活性物质吐温。 第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用 70%酒精浸 1030 秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之 70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用 70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
9、 第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取。 第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次 3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗 3-l0 次左右。无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡 5 分钟。升汞的渗透力弱，一般浸泡 10 分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。在消毒液中加入浓度为 0.080.12%的吐温20或 80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果
10、。 取出材料，用消毒滤纸吸干，将茎类切成 3-6mm 大小，接种于诱芽培养基（MS+BA 0.1+NAA 0.05mg/L+蔗糖 3%+琼脂 0.8%，pH5.6-6.0），茎段部分要求带侧芽。 3.接种步骤： （1）一手拿摄子夹住茎稍末端，放于无菌滤纸上，一手持解剖刀，去除嫩叶，将茎尖部分切成 2-6mm 大小。 （2）一手拿装有培养基的三角瓶或试管，解开封口纸，在酒精灯火焰上转动烧烤灭菌。 （3）用镊子夹住茎尖、茎段，放入培养基表面，使茎尖成直立状态。 （4）培养条件：培养室温室（252），光照强度1500-2000lX，每天光照 10-12h。 4.观察记载：接种培养后每隔 5d 左右观
11、察记载 1 次，观察茎尖出芽情况，及时清除污染材料。经历一个月左右，试管苗可长到 2cm 以上，将这些小苗切割成茎尖、茎段，接种于诱导培养基，又可长出无根苗。反复切割可大量快速繁殖，或将无根苗转至生根培养基（1/2MS+NAA 0.1mg/L）诱导出完整的植株。最后统计记载下列指标。 （1）污染率%=污染的外植体数/接种数100%； （2）死亡率率%=死亡的外植体数/接种数100%； （3）愈伤诱导率%=产生愈伤组织块数/（接种数-污染外植体数）100%； （4）增值系数=继代后的芽苗数/继代前的芽苗数； （5）生根率%=生根的小苗数/总苗数100%； （6）成活率%=移栽成活的试管苗数/移栽
12、总试管苗数100%； （四）驯化练苗 （四）驯化练苗 待根长至 1-2cm 时，可将瓶苗移至温室大棚中，开瓶炼苗 3d后，再移至基质中，保持 75%湿度和 50%自然光照。 五、作业与思考五、作业与思考 1.何谓外植体?如何进行选择和处理？ 2.何谓诱导培养基、 分化培养基、 增殖培养基和生根培养基？它们的成分有何不同？ 3.组培污染的原因和控制方法。 附：MS 培养母液的配制附：MS 培养母液的配制（单位：mg） 母液编号 化合物名称 规定量 扩大倍数称取量 母液体积 （ml） 母 液 I 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO47H2O KH2PO4 CaCl27H2O 1900 16
13、50 370 170 440 10 10 10 10 10 19000 16500 3700 1700 4400 100 母 液 II 微量元素 MnSO44H2O ZnSO44H2O H3BO3 KI Na2MoO42H2O CuSO45H2O CoCl26H2O 22.8 8.60 6.20 0.83 0.25 0.025 0.025 100 100 100 100 100 100 100 22800 860 620 83 25 2.5 2.5 100 母 液 III 微量元素 Na2EDTA FeSO47H2O 37.3 27.8 200 200 7460 5560 100 母 液 IV 有机附加 物 甘氨酸 维生素 B1 维生素 B2 烟酸 肌醇 2.0 0.1 0.5 0.5 100 50 50 50 50 50 100 5 25 25 500 100
