昆明爱科特生物科技有限公司β甘露聚糖酶

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1、昆明爱科特生物科技有限公司-甘露聚糖酶酶活力测定方法 1 - -甘露聚糖酶酶活力的测定（甘露聚糖酶酶活力的测定（DNSDNS 法）法） 1 -甘露聚糖酶酶活力单位定义 在 37、pH 值为 5.5 的条件下，每分钟催化浓度为 9mg/mL 的甘露聚糖溶液生成 1mol 甘露糖所需的酶量定义为一个-甘露聚糖酶酶活力单位 IU。 2 测定原理 -甘露聚糖酶可将甘露聚糖水解为寡糖和单糖。 含有游离醛基或酮基的寡糖和单糖在碱性沸水浴的条件下与 3，5二硝基水杨酸反应生成橘红色的 3-氨基-5-硝基水杨酸。该化合物在 540nm 处有最大吸收，在一定的浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系。而反应液中

2、还原糖（以 D-甘露糖计）的生成量又与-甘露聚糖酶的酶活力成线性关系。因此，可通过分光比色法测定反应液的光吸收值，利用标准曲线方程来计算反应液中还原糖的含量，进而反映出-甘露聚糖酶的酶活力。 3 仪器与设备 3.1 实验室用样品粉碎机或研钵。 3.2 分样筛 孔径为 0.25mm（60 目） 。 3.3 分析天平 感量 0.001g。 3.4 pH 计 精确至 0.01。 3.5 磁力搅拌器（带有加热功能） 3.6 涡旋混合器 3.7 烧结玻璃过滤器 孔径为 0.45m。 3.8 恒温水浴锅 精度为 0.1。 3.9 秒表 每小时误差不超过 5 秒。 3.10 可见分光光度计 昆明爱科特生物科

3、技有限公司-甘露聚糖酶酶活力测定方法 2 能检测 350nm800nm 的吸光度范围。 3.11 离心机 4000r/min 3.12 移液器 精度为 1L。 3.13 可调压电炉 3.14 高压灭菌锅 3.15 冰箱 3.16 耐高温玻璃器皿 4 试剂与溶液 除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水为去离子水。 4.1 乙酸（CH3COOH）溶液，浓度为 0.1mol/L （1）在 250mL 烧杯中加入 80mL 去离子水。 （2）精确吸取 0.60mL 冰乙酸于烧杯中。 （3）用去离子水定容至 100mL。 4.2 乙酸钠(CH3COOH3H2O)溶液，浓度为 0.1mol/L （1）在

4、250mL 烧杯中加入 80mL 去离子水。 （2）加入 1.36g 三水乙酸钠于烧杯中，搅拌溶解。 （3）用去离子水定容至 100mL。 4.3 0.1mol/L，pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液 （1）在 1000mL 烧杯中加入 800mL 去离子水。 （2）加入 11.57g 三水乙酸钠和 0.85mL 冰乙酸于烧杯中，搅拌溶解。 （3）测定溶液的 pH，若 pH 偏离 5.5，用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至 5.5。 （4）用去离子水定容至 1000mL。 （5）室温储存，用前要检查 pH。若要长期储存，需加入 0.2%的叠氮化钠来防止微生物生长变质。 4.4 1mol/L，pH5.5

5、 的乙酸-乙酸钠缓冲液 （1）在 250mL 烧杯中加入 80mL 去离子水。 （2）加入 13.608g 三水乙酸钠于烧杯中，搅拌溶解。 昆明爱科特生物科技有限公司-甘露聚糖酶酶活力测定方法 3 （3）用冰乙酸调 pH 至 5.5。 （4）用去离子水定容至 100mL。 （5）室温储存，用前要检查 pH。 4.5 D-甘露糖（C6H12O6）储备液，浓度为 10mg/mL （1）称取 1.000g 无水 D-甘露糖于 100mL 容量瓶中。 （2）用 0.1mol/L，pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解并定容至 100mL。 4.6 D-甘露糖（C6H12O6）标准液，浓度为 1mg/mL

6、 （1）吸取 10mLD-甘露糖储备液于 100mL 容量瓶中。 （2）用 0.1mol/L，pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液定容至 100mL。 4.7 1%（w/v）甘露聚糖溶液 （1）打开磁力搅拌加热器。 （2） 在 250mL 耐高温高压三角瓶中准确加入 90mL 去离子水，同时加入一个磁力搅拌子。 （3）加热至约 60。 （4）称取 1.000g 甘露聚糖（Sigma G0753） 。 （5）边搅拌边将甘露聚糖全部加入热水中，在加入过程中不可形成团块。 （6）将三角瓶放入高压灭菌锅中，在 121条件下加热 20min。 （7）加热完毕，取出，迅速冷却至室温， （8）加入 10mL 1

7、mol/L，pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液，在磁力搅拌器上继续搅拌 10min。 （9）在离心机（4000r/min）中离心 5min （10）上清液甘露聚糖溶液能立即使用，每次取时要摇匀。 （11）4避光保存，有效期为 3 天。 4.8 DNS 试剂 （1）称取 20gNaOH 于 1000mL 棕色广口瓶中。 （2）加入 500mL 去离子水。 （3）边搅拌边溶解，同时边加入 6.30g 3，5二硝基水杨酸，不断搅拌直到溶液清澈透明（注意：整个溶解过程溶液温度不可超过 48） 。 （4） 边搅拌边依次加入四水酒石酸钾钠 182.0g， 苯酚 5.0g， 无水亚硫酸钠 5.0g，昆明爱科特

8、生物科技有限公司-甘露聚糖酶酶活力测定方法 4 同时补加水 150mL，不断搅拌直到溶液清澈透明（注意：整个溶解过程溶液温度不可超过 48） 。 （5）冷却至室温，用去离子水定容至 1000mL，贮于棕色瓶中避光静置 7 天。 （6）用烧结玻璃过滤器过滤即可使用，滤液储存在棕色试剂瓶中并盖紧塞子可稳定保存 6 个月。 安全须知： （1）在配制以上试剂时需戴上防护眼镜和乳胶手套。 （2）实验应在通风橱或通风良好的环境中进行。 （3）总是酸往水里加。 （4）一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，应及时用大量的水冲洗。 5 标准曲线的绘制 （1） 准备 21 支试管，每支试管按下表加液 试管号 （试管数）

9、D-甘露糖标 准液体积（mL） 缓冲液（4.3） 体积（mL） D-甘露糖 含量（mg） 0（1 支） 0 2 0 1（2 支） 0.1 1.9 0.1 2（2 支） 0.2 1.8 0.2 3（2 支） 0.3 1.7 0.3 4（2 支） 0.4 1.6 0.4 5（2 支） 0.5 1.5 0.5 6（2 支） 0.6 1.4 0.6 7（2 支） 0.7 1.3 0.7 8（2 支） 0.8 1.2 0.8 9（2 支） 0.9 1.1 0.9 10（2 支） 1.0 1.0 1.0 （2）向以上各试管中加入 3mLDNS,并振荡混匀。 （3）将以上各试管放于沸水浴中准确煮沸 5min

10、（注意：水沸腾后开始计时） 。 （4） 取出， 迅速冷却至室温， 向每支试管中再加入 10mL 去离子水， 并振荡混匀。 （5）以 0 号管为对照调零，在 540nm 波长下测定吸光度 OD 值。 昆明爱科特生物科技有限公司-甘露聚糖酶酶活力测定方法 5 （6）以吸光度 OD 值为 X 轴，D-甘露糖含量（mg）为 Y 轴，绘制标准曲线，曲线设定时不通过原点，获得相关线性方程 y=kx+b 和相关系数 R2值，使得 R20.99，否则须重做。 6 试样的稀释制备 （1）取有代表性固体样品，用四分法将试样缩分至 50g，然后粉碎或充分碾碎过 60 目筛。 （2） 精确称取过 60 目筛的试样 1

11、.000g 于 100mL 三角瓶中， 加入 10mL 0.1mol/L，pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液和一个磁力搅拌子，在磁力搅拌器上室温搅拌30min60min。 （3）将试样搅拌液用 0.1mol/L，pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至合适倍数（在该稀释倍数下反应液最终 OD 值在 0.200.35 之间） ， 每次稀释倍数最大不超过 10 倍。 （4）液体试样可直接用 0.1mol/L，pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释。若稀释后酶液的 pH 偏离 5.5，需要用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节 pH 至 5.5，然后再用缓冲液稀释到适当倍数。 试样稀释倍数如下表： 稀释倍数 液体试样

12、或 10 倍 固态试样稀释液（mL） 0.1mol/L， pH5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液体积（mL） 10 0.5 4.5 5 1.0 4.0 4 1.25 3.75 2 2.5 2.5 7 测定步骤 （1）标准空白样的制备：吸取乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.3）2.0mL,加入 3mLDNS试剂 （4.8） ， 沸水浴加热 5min， 用自来水冷却至室温， 再加去离子水 10mL，振荡摇匀做为标准空白样。 （2）取 3 支试管，每支试管中加入 1.8mL 1%（w/v）甘露聚糖溶液,其中 1 支试管作为酶样空白管，其余 2 支试管作为酶样分析管。 注意：加入甘露聚糖溶液时应缓慢，不可粘在试管壁

13、上。 昆明爱科特生物科技有限公司-甘露聚糖酶酶活力测定方法 6 （3）将 3 支试管放于 371水浴锅中保温 5min。 （4）每隔一定时间，向 2 支酶样分析管中加入 0.2mL 稀释到适当倍数的酶液，向酶样空白管中先加入3mLDNS试剂振荡摇匀后再加入0.2mL稀释到适当倍数的酶液。每支试管中加入溶液后均需振荡混匀。 注意：酶液一定要垂直加在底物上面，不可顺着试管壁加入。 （5）3 支试管在 371水浴锅中准确反应 30min。 （6） 按照加酶液顺序及间隔时间，向酶样分析管中分别加入 3mLDNS 试剂阻止反应，然后振荡均匀。 （7）将 3 支试管放于沸水浴中准确煮沸 5min，取出后自

14、来水冷却至室温。 （8）向每支试管中分别加入 10mL 去离子水，然后振荡均匀。 （9）以标准空白样调零，在 540nm 波长下分别测定酶样空白管和酶样分析管的吸光度 OD 值，分别记为 ODB、ODE1、ODE2。 8 酶活力计算 -甘露聚糖酶酶活力（U/g 或 U/mL） E1E2 BODODK-OD+b2100030 0.2 180.20N+=式中： K标准曲线的斜率 b标准曲线的截距 1000转化因子，毫克转化为微克 N试样的总稀释倍数 30反应时间，min 0.2反应酶液的体积，mL 180.20D-甘露糖的摩尔质量 酶活力的计算值保留 3 位有效数字 9 重复性控制 （1） 每次分析测定过程，同时测定一个已知酶活力的-甘露聚糖酶标准品作为对照，用来检查整个分析测定过程的准确性。标准品的酶活力测定值的相昆明爱科特生物科技有限公司-甘露聚糖酶酶活力测定方法 7 对偏差应在其最近 5 次测定值平均值的10%以内。 （2）若无已知酶活力的标准品，可选择一个稳定的试样分别测 3 次其酶活力，使得 3 个平行测定值的相对偏差在8%以内，然后计算其平均酶活力做为该标准品的酶活力。 （3）同一试样两个平行测定值的相对偏差在8%以内，二者的平均值为最终的酶活力测定值。